TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

PHÙNG NGỌC MỸ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTERXYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Hà Nội, tháng 11 năm 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

PHÙNG NGỌC MỸ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTERXYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Xuân Thành. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa
luận là trung thực, không trùng lặp với bất kì công trình nghiên cứu nào.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
SINH VIÊN

Phùng Ngọc Mỹ Lan


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.

Lý do chọn đề tài ......................................................................... 1

2.

Mục đích nghiên cứu................................................................... 2

3.

Nội dung nghiên cứu ................................................................... 2

4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................... 2

................................................................................................................. 18
KẾT LUẬN...........................................................................................21
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 22


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Ứng dụng của VLC ............................................................................ 5
Bảng 2. Môi trường chuẩn lên men tạo màng VLC........................................ 13
Bảng 3. Giá trị OD của dung dịch thuốc berberine hydrochloride ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) .............................................................................. 17
Bảng 4. Giá trị OD của dung dịch berberine hydrochlorid 10% khi ngâm màng
VLC (n = 3) ở môi trường chuẩn .................................................................... 19
Bảng 5. Lượng thuốc berberine hydrochlorid hấp thụ vào màng VLC
( n = 3) ............................................................................................................. 20


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của vật liệu cellulose và cellulose thực vật ......................... 3
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride ................................ 7
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lí thu VLC tinh khiết ......................................... 14
Hình 3.1 Màng VLC thô lên men từ môi trường chuẩn.................................. 16
Hình 3.2 Màng VLC tinh khiết sau khi xử lí .................................................. 17
Hình 3.3 Phương trình đường chuẩn berberine hydrochlorid ......................... 18
Hình 3.4 Màng VLC đang hấp thụ thuốc ........................................................ 19


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT


chế bệnh rối loạn đường tiêu hóa,…trong đó các thuốc berberine hydrochloride.
Berberine hydrochloride là một trong các số loại thuốc đường tiêu hóa
dùng qua đường uống, khó tan trong ethanol và nước, không tan trong ether.
Nó có tác dụng chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng trong ruột gây hại cho
cơ thể mà không ảnh hưởng tới các hoạt động của vi sinh vật có lợi của đường
tiêu hóa. Beberine hydrocochloride còn được điều chế thành thuốc nhỏ mắt
điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc
do đau mắt hột gây nên berberine hydrochloride còn có khả năng ngăn ngừa sự
lây lan của nấm, bột nhiễm nấm, chống lại sự tác hại của vi khuẩn tả, E. coli.
Berberine hydrochloride có tác dụng phụ gây ra táo bón, nếu dùng với liều cao
berberine trên 500 mg có thể gây ra đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, căng thẳng,
trầm cảm, nhịp tim chậm, suy tim, co giật, tê liệt, co thắt và dẫn đến tử vong.
Tuy nhiên, berberine hydrochloride có sinh khả dụng thấp, trong quá
trình sử dụng có thể bị các tác nhân khác gây ảnh hưởng làm giảm hiệu quả hấp
thụ. Do đó, cần thiết để thiết kế một loại màng giúp thuốc hấp thụ một cách
nhanh chóng có thể tăng khả năng điều trị bệnh của berberine hydrochloride.
[2].
Với mục đích tạo ra màng VLC dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng
Gluconacetobacter xylinus, từ đó chế tạo màng sinh học để khắc phục những
tác dụng phụ của thuốc berberine hydrochloride ở môi trường thích hợp nhất.
Đó là lý do chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cức khả năng hấp thụ thuốc
1


berberine hydrochloride của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo hệ thống VLC được nạp thuốc, tìm hiểu khả năng nạp thuốc nhằm
tìm ra điều kiện nạp được nhiều và hấp thụ được nhiều thuốc vào VLC.
- Đánh giá khả năng hấp thụ thuốc ở các trường hợp khác nhau về độ dày

Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc
glucosepyranose nối với nhau bởi nối β -1,4 glucan. Các nghiên cứu cơ bản về
VLC cho thấy VLC có cấu trúc giống cellulose thực vật. Tuy nhiên cấu trúc
cao phân tử và các đặc tính của VLC khác với cellulose thực vật được thể hiện
qua hình 1.1.

(x 20000 lần)
Vật liệu cellulose

(x 200 lần)
Cellulose thực vật

Hình 1.1. Cấu trúc của vật liệu cellulose và cellulose thực vật
Nguồn: Brown R.M. (1999), Pure Appl. Chem. 71 (5) [17].
3


Vật liệu cellulose là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không
gắn lignin, có thể bị phân hủy bởi một số enzym: CBH I và EG II là hỗn hợp 2
enzym cellulase được tinh chế từ Tricoderma viride với tên thương mại là
Meicelase (Meiji Seika, Tokyo, Japan) có khả năng thủy phân VLC. Có thể
kiểm soát được kích thước, cấu trúc (dạng A - VLC hay S - VLC) và chất lượng
của cellulose (kiểm soát cellulose kết tinh) trong quá trình nuôi cấy tạo
cellulose.
1.1.2. Tính chất của màng vật liệu cellulose
Vật liệu cellulose là cellulose trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, sức
căng và độ bền sinh học cao.
VLC có độ bền cơ học, hóa học cao và có khả năng cản vi khuẩn. Với
tính chất này màng VLC đã được chế tạo làm màng lọc cản khuẩn.
Khả năng hút nước của VLC lớn hơn rất nhiều so với cellulose thực vật

chất để cố định protein; làm màng bọc thực phẩm,…
Sản phẩm VLC hiện được mong đợi là vật liệu hoá sinh mới với những
ứng dụng thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển hàng loạt [2], [4], [3],
[5], [7], [8], [11], [16], [20], [21] được thể hiện cụ thể trong bảng 1.
Bảng 1. Ứng dụng của VLC

Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm
Tráng miệng (thạch dừa)
Ăn kiêng (kem, salad)
Thịt nhân tạo

Thực phẩm
Vỏ bao xúc xích
Nước uống siro không có cholesterol
Thuốc rượu Kombucha hay trà Manchurian
Màng trị thương, màng trị bỏng
Y dược

Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch

5


Màng nhân tạo
Mỹ phẩm



1.2. Giới thiệu về thuốc berberine hydrochloride
- Berberine hydrochloride là muối ammonium bậc bốn từ nhóm alkaloid
isoquinoline protoberberine.
- Berberine hydrochloride thường có trong rễ, rễ thân, thân, vỏ cây những
cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis,… và có nhiều trong rễ cây vàng
đắng với tỷ lệ 1, 5 - 3%, berberine hydrochloride chiếm ít nhất là 82% so với
alkaloid toàn phần . Berberine hydrochloride thường có lẫn các tạp chất alcaloid
khác như: palmatin, jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%,
jatrorrhizin không quá 5%.

6


* Tính chất vật lí và tính chất hóa học:
+ Tính chất vật lí: là tinh thể hay bột màu vàng, không mùi, có vị đắng.
Độ chảy ở dạng base là 1450C (độ phân hủy), hơi tan trong ethanol và khó tan
trong ether. Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, dễ tan trong nước
sôi, ethanol, thực tế không tan trong clorofrom, ether. Dạng muối sulfat dễ tan
trong nước ở tỉ lệ 1/30, tan trong ethanol [1].
+ Tính chất hóa học: có tính chất như một base bậc 4, tạo muối bằng cách
thay thế nhóm OH. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride được trình
bày trên hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride
 Công thức phân tử: C20H18ClNO4.
 Khối lượng phân tử: 371,5 đvC.
- Chống chỉ định: phụ nữ có thai.
- Tác dụng phụ: táo bón.
* Tác dụng dược lý: Berberine hydrochloride có tác dụng kháng vi trùng

có khả năng ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm:
ung thư vú, ung thư biểu mô, ung thư tụy,… mà không làm ảnh hưởng đến sự
phát triển của các tế bào bình thường trong nồng độ nhất định [7, 8].

8


1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Tình hình nghiên trên thế giới:
- Màng VLC:
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về các ứng dụng của màng VLC
trong nhiều lĩnh vực như: lĩnh vực thực phẩm với màng bọc trái cây hay chất
ổn định thực phẩm; lĩnh vực y học với việc tạo ruột giả, mạch máu nhân tạo.
Ở Brazil, màng VLC ướt tinh sạch như một loại da nhân tạo được sản
xuất và bán ra thị trường để đắp vết thương.
Màng VLC còn được nghiên cứu để làm vật liệu vận chuyển thuốc và
điều khiển quá trình giải phóng thuốc [19].
Năm 2017, Badshah M, Ullah H, Khan S. A, Park J. K, Khan T đã công
bố nghiên cứu VLC được lên men từ môi trường chuẩn có tiềm năng làm hệ
vận tải và phân phối thuốc qua đường uống [17].
Năm 2013, Huang và cộng sự đã sử dụng VLC được lên men từ môi
trường chuẩn dùng cho vận tải và giải phóng berberine in vitro [18].
- Thuốc berberine hydrochloride:
Một số nghiên cứu đã chứng minh, nếu dùng phối hợp một số thuốc
kháng sinh với berberine hydrochloride sẽ hạn chế được tác dụng không mong
muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột. Trong
các thử nghiệm lâm sàng ở Trung Quốc và một số nước châu Á, berberine
hydrochloride đã được dùng và chứng minh là có tác dụng tốt với nhiều bệnh
tim mạch. Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, berberine hydrochloride còn có
tác dụng hạ huyết áp, cường tim và chống loạn nhịp. Các nhà khoa học cũng

nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial
cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả cho thấy màng VLC tạo bởi
Acetobacter xylinum BNH2 tổng hợp có sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền cao, độ
thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng [10].
Năm 2018, Nguyễn Xuân Thành đã có nghiên cứu đánh giá sự hấp thụ
famotidine của cellulose được tạo ra từ Acetobacter xylinum trong một số môi
trường nuôi cấy [5].

10


Năm 2018 Nguyễn Xuân Thành đã có nghiên cứu bào chế và đánh giá
sự giải phóng cimetidine in vitro của vật liệu vật liệu cellulose nạp thuốc được
tạo ra từ Acetobacter xylinum định hướng dùng cho đường uống.
Năm 2018, Nguyễn Xuân Thành, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy,
Phùng Thị Kim Huệ, Triệu Nguyên Trung đã có nghiên cứu tối ưu hóa hiệu
suất nạp thuốc famotidin của vật liệu vật liệu cellulose lên men từ dịch trà xanh
theo phương pháp đáp ứng bề mặt và mô hình Box-Behnken [13].
Nguyễn Xuân Thành, Phạm Văn Hào đã nghiên cứu hệ trị liệu qua da
chứa curcumin từ vật liệu cellulose được sản xuất từ vi khuẩn trong dịch trà
xanh lên men .
- Thuốc berberine hydrochloride:
Cao Bá Cường, Nguyễn Xuân Thành đã nghiên cứu khả năng hấp thụ
thuốc berberine của một số màng bacterial cellulose lên men từ vi khuẩn
Acetobacter xylinum .
Nguyễn Hoài Nam, Võ Phùng Nguyên, Trần Hùng đã nghiên cứu tác
động của berberine hydrochloride và palmatin trên trí nhớ hình ảnh và không
gian của chuột nhắt [9].
Hồ Cảnh Hậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn Văn
Thuận, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyễn Tuấn Quang đã nghiên cứu định lượng

- Cân phân tích (Sartorius – Thụy Sỹ).
- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA.
- Máy lắc tròn (Orbital Shakergallenkump – Anh).
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức).
- Tủ lạnh Electrolux.
- Bình tam giác, hộp lồng, ống nghiệm, pipet,...
2.1.4. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy màng VLC
Gluconacetobacter xylinus được nuôi cấy trong môi trường chuẩn.
Thành phần và khối lượng các chất có trong môi trường nuôi cấy màng VLC
được thể hiện trong bảng 2.

12


Bảng 2. Môi trường chuẩn lên men tạo màng VLC

Trọng lượng

Thành phần
D – glucose

20g

Peptone

5g

Cao nấm men

5g

thu được màng VLC thô tiếp tục sử lí màng thu được màng VLC tinh khiết.

13


2.1.1.2. Xử lí màng VLC trước khi hấp thụ thuốc
Xử lí màng VLC thô để thu được màng VLC tinh khiết theo quy trình
hình 2.1.
Tách màng VLC thô
Rửa bằng nước cất
Cho vào bình NAOH 3%
Hấp trong 113oC, 15 phút
Xả nước 24 giờ
Thu VLC tinh khiết
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lí thu VLC tinh khiết
2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn
- Chuẩn bị dung dịch cồn 960C.
- Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc berberine hydrochloride ở các nồng độ
khác nhau là: 5%; 10%; 20%; 30%; 40%; 50%.
- Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo cường độ quang phổ các
dung dịch đã pha ở bước sóng 345nm [23].
- Mỗi trường hợp đo 3 lần rồi lấy kết quả trung bình.
- Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình đường chuẩn của
berberine hydrochloride bằng phần mềm Excel 2013.
- Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có
dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tương quan
Trong đó :

x : Nồng độ thuốc (mg/ml)


(3)

Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng.
mht (mg/cm3): khối lượng thuốc hấp thụ trong 1 đơn vị thể tích
màng.
m0 (mg/cm3): khối lượng thuốc trong 1 đơn vị thể tích ban đầu
2.2.4. Phương pháp phân tích thống kê
Các số liệu được phân tích xử lý thông qua phần mềm Excel 2013.
Kiểm định giả thuyết về giá trị trung bình giữa 2 mẫu bằng hàm: t – Test:
Two Sample Assuming Unequal Variences với ý nghĩa α = 0,05 (những khác
biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05. Tất cả các dữ liệu được
trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn “MEAN ± SD” .
15


Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Kết quả tạo vật liệu VLC
3.1.1. Thu màng VLC thô
Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus khi cho vào môi trường nuôi cấy sẽ
sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường để tạo nên màng VLC. Độ dày của
màng phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy và điều kiện chất dinh dưỡng.
Sau khoảng 10 – 15 ngày, thu màng VLC có độ dày 0,3cm và 0,5cm từ
môi trường chuẩn như hình 3.1.

a. Màng VLC thô 0,3cm

b. Màng VLC thô 0,5cm

c. Màng VLC thô (d = 8cm)