Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EGFR Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG
TẾ BÀO NHỎ
Lê Kiều Minh*, Trần Văn Ngọc**, Russell Ronald Braeuer***

TÓMTẮT
Đặt vấn đề: Đột biến gen EGFR xảy ra ở giai đoạn rất sớm và có tỷ lệ cao trong ung thư phổi không tế
bào nhỏ (UTPKTBN). Liệu pháp điều trị trúng đích mang lại nhiều hiệu quả tốt trong việc điều trị cho các
bệnh nhân UTPKTBN. Xác định đột biến gen có ý nghĩa quan trọng giúp bác sĩ trong việc lựa chọn phác đồ
điều trị thích hợp để nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.
Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu này nhằm mô tả phổ đột biến của gen EGFR trên bệnh nhân Việt
Nam, giúp tiên đoán đáp ứng lâm sàng với nhóm thuốc phân tử nhỏ TKIs.
Đối tượng, phương pháp nghiên cứu: Từ tháng 06/2015 đến tháng 12/2015, 64 bệnh nhân
UTPKTBN được khảo sát đột biến gen EGFR. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng để
khuếch đại vùng chứa các exon 18 – 21 của EGFR từ bệnh phẩm là mô vùi nến. Sau đó đột biến của EGFR
được xác định bằng kỹ thuật pyrosequencing.
Kết quả: 43/64 (67,2%) bệnh nhân UTPKTBN có đột biến gen EGFR, trong đó có 1 trường hợp đột
biến G719S exon 18 (2.3%), 25 đột biến mất đoạn tại exon 19 (58,1%), 8 đột biến T790M exon 20 (18,6%),
13 đột biến L858R (30,2%) và 1 đột biến L861Q (2,3%) tại exon 21. Có 5 trường hợp tồn tại 2 đột biến.
Kết luận: Bệnh nhân Việt Nam bị UTPKTBN có tần suất đột biến EGFR cao với tỷ lệ 67,2% (43/64).
Kỹ thuật pyrosequencing là một kỹ thuật bổ trợ tốt trong việc xác định đột biến gen EGFR từ mẫu mô
UTPKTBN.
Từ khóa: Ung thư phổi tế bào không nhỏ; đột biến gen EGFR; liệu pháp điều trị trúng đích;
pyrosequencing.

ABSTRACT
DETECTION OF EGFR MUTATIONS IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER
Le Kieu Minh, Tran Van Ngoc, Russell Ronald Braeuer

Methods: From June to December 2015, 64 patients were detected for EGFR gene mutations.
Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the region containing exons 18-21 of EGFR from
formalin-fixed, paraffin-embedded lung carcinoma tissues. Then EGFR mutations were analyzed by using
pyrosequencing.
Results: 43/64 (67.2%) patients with EGFR mutations, including 1 case with G719S mutations exon
18 (2.3%), 25 deletions in exon 19 (58.1%), 8 cases with T790M mutation in exon 20 (18.6%), 13 cases
with L858R mutation (30.2%) and 1 with L861Q mutation (2.3%) in exon 21. There were 5 cases occurred
2 mutations.
Conclusion: High EGFR mutation rate occurs Vietnamese NSCLC patients with 67,2% (43/64).
Pyrosequencing is a good complementary technique in determining EGFR mutations in NSCLC patients.
Keywords: Non-small cell lung cancer; EGFR mutation; Targeted therapy; Pyrosequencing.
tại của gen kích hoạt ung thư trong các tế bào
ĐẶTVẤNĐỀ
ung thư và đó cũng là mục tiêu của những
Ung thư phổi là một trong năm loại ung
nghiên cứu trong tương lai cũng như khuyến
thư phổ biến nhất ở cả nam và nữ giới trên thế
cáo điều trị phòng ngừa bệnh ung thư phổi. Một
giới trong đó có Việt Nam(16). Tỷ lệ
vài nghiên cứu cũng đã cho thấy việc áp dụng
sống của bệnh nhân ung thư phổi khá thấp,
các kỹ thuật sinh học phân tử trong tầm soát,
khoảng 15,7% ở Mỹ và có khoảng 1,2 triệu
chẩn đoán và điều trị đã mang lại nhiều lợi ích
bệnh nhân tử vong mỗi năm trên thế giới (16, 19).
cho bệnh nhân ung thư.
Theo dự báo, con số này còn có xu hướng tăng
Những nghiên cứu về sự biến đổi gen làm
trong những năm tiếp theo tạo nên mối đe dọa
thay đổi sự cân bằng của hoạt động sống tế

Khoảng 80 - 90% các trường hợp ung thư
factor receptor) gồm gefitinib và erlotinib, đã
phổi là thể không tế bào nhỏ, còn lại là thể tế bào
có những hiệu quả nổi bật đối với bệnh nhân
nhỏ (17). Hiện nay, ung thư phổi thường được
UTPKTBN và được xác định có đột biến
chẩn đoán ở giai đoạn rất muộn vì căn bệnh này
EGFR. Các đột biến gen EGFR ở bệnh nhân
không cho thấy triệu chứng cụ thể, hầu hết các
UTPKTBN thường thấy có liên quan với đột
trường hợp khi phát hiện đều rơi vào giai đoạn
biến ở bốn exon 18, 19, 20, 21 mã hóa vùng
tiến triển hoặc di căn. Nhiều nghiên cứu gần đây
tyrosine kinase, và nhiều nghiên cứu đã cho
về di truyền học phân tử đã phát hiện ra sự tồn

Hô Hấp

105


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

thấy những bệnh nhân này thường đáp ứng
tốt với thuốc điều trị đích (15). Việc xác định đột
biến gen EGFR ở bệnh nhân UTPKTBN cung
cấp thông tin quan trọng cho bác sĩ lâm sàng
để chỉ định LPĐTTĐ. Hiện nay có nhiều kỹ

UTPKTBN được thu thập tại Bệnh viện 115,
Bệnh viện Thống Nhất, Bệnh viện Chợ Rẫy và
Bệnh viện quốc tế City. Các mẫu bệnh phẩm
được thu nhận từ khối u qua phương pháp phẫu
thuật, sinh thiết phế quản (nội soi phế quản ống
mềm, sinh thiết mù xuyên phế quản, sinh thiết
xuyên phế quản dưới hướng dẫn màu huỳnh
quang) hoặc sinh thiết phổi từ ngoài. Mẫu bệnh
phẩm được tiến hành xét nghiệm chẩn đoán giải

106

phẫu bệnh qua mô bệnh học hoặc xét nghiệm
hóa mô miễn dịch. Các mẫu mô ung thư phổi
được đúc trong paraffin (sáp nến) và được tìm
đột biến gen EGFR tại Phòng xét nghiệm Nam
Khoa-Biotek, Thành phố Hồ Chí Minh.

Phương pháp nghiên cứu
- Kỹ thuật tách chiết DNA
Mẫu mô vùng tế bào ung thư được đúc
thành mô vùi nến dùng để chẩn đoán giải phẫu
bệnh. Xylene (Merck, Đức) được sử dụng để khử
nến, sau đó được rửa lại bằng ethanol tuyệt đối
và để khô trước khi ủ với proteinase K (Qiagen,
Đức) trong dung dịch đệm ở 56oC trong 1 giờ và
90oC trong 1 giờ kế tiếp. DNA sau khi tách chiết
được tinh sạch sử dụng bộ QIAamp DNA FFPE
Tissue Kit (Qiagen, Đức). DNA được kết tủa
bằng ethanol tuyệt đối trong dung dịch đệm AL

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 μM cho mỗi
loại), 1,25 unit HotStart Taq Polymerase (Qiagen,
Đức) và 50 ng genomic DNA. Chu kỳ luân nhiệt
được thực hiện trên máy ³Prime Thermal Cycler
(Techne, Anh) bao gồm giai đoạn biến tính ban
đầu ở 95oC trong 15 phút, theo sau bằng 42 chu
kỳ gồm biến tính ở 95oC trong 20 giây, gắn mồi ở
53oC trong 30 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 72oC
trong 20 giây và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài
sản phẩm ở 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR
được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose
2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát
dưới màn soi gel. Kết quả đạt yêu cầu khi kết
quả điện di tại mỗi exon cho 1 band DNA được
khuếch đại dương, kích thước sản phẩm tại mỗi
exon là: exon 18 (171 bp), exon 19 (163bp), exon
20 (291 bp) và exon 21 (97 bp).

Nghiên cứu Y học

kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide. Kết
quả được phân tích bằng phần mềm
PyroMark Q24 trên máy tính. Các số liệu được
xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0.

KẾT QUẢ
Đặc điểm lâm sàng - giải phẫu bệnh
Trong thời gian từ tháng 06/2015 – 12/2015,
chúng tôi đã tiến hành phân tích đột biến gen

1
2.3%
một sợi DNA được giải trình tự, và giải trình
Deletions tại exon 19
25
58.1%
sợi DNA bổ sung bằng phản ứng của enzyme.
T790M tại exon 20
8
18.6%
43
L858R
tại
exon
21
13
30.2%
Giải trình tự bằng việc tổng hợp dựa trên
L861Q tại exon 21
1
2.3%
nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải
2 đột biến trở lên
5
11.6%
phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra
một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật
Bảng 2: Tương quan đột biến gen với đặc điểm lâm sàng - giải phẫu bệnh

Giới tính

(n = 43)
24
19
26
17
18
12
13

Tỷ lệ %
63,2%
73,1%
65%
70,8%
81.8%
70.5%
52%

p
0,41
0,73

0,09

Còn hút thuốc hoặc bỏ hút thuốc lá dưới 1
năm trước khi chẩn đoán.
c

Bỏ hút thuốc lá trên 1 năm trước khi chẩn
đoán.

G, làm cho acid amin Leucine (L) tại codon 858
biến đổi thành Arginine (R), gây nên đột biến
L858R ở bệnh nhân MS41 (Hình 1B). Tại vị trí
nucleotid 2369 trên exon 20 xuất hiện thêm
một đỉnh C bị biến đổi thành T, làm cho acid
amin Threonine (T) tại codon 790 bị biến đổi
thành Methionine (M), gây nên đột biến
T790M ở bệnh nhân MS33 (Hình 1C).

BÀN LUẬN
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy
khoảng 5% - 60% bệnh nhân UTPKTBN mang
đột biến EGFR xuất hiện trên 4 exon của gen, từ
exons 18 đến 21 (12, 2, 23). Tỷ lệ đột biến EGFR dao
động trong khoảng 5% - 15% ở người da trắng (2,
4) và khoảng 38% - 58% ở bệnh nhân Đông Á (8, 23).
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật pyrosequencing
được sử dụng để khảo sát 4 exon này cho 64
bệnh nhân, phát hiện 43 trường hợp có đột biến
EGFR (67,2%) (Bảng 1). Kết quả này tương đồng
với ghi nhận của PIONEER năm 2012 về tỷ lệ đột
biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi
carcinôm tuyến tại Việt Nam. Nghiên cứu
PIONEER tiến hành trên 1450 mẫu ung thư phổi
carcinôm tuyến tại 7 nước Châu Á: Việt Nam,
Đài Loan, Thái Lan, Philippin, Trung Quốc,
Hồng Kong, Ấn Độ bằng phương pháp Scorpion
ARMS (Therascreen EGFR RGQ kit). Kết quả từ
nghiên cứu cho thấy Việt Nam là nước có tỷ lệ
đột biến EGFR cao nhất trong 7 nước với 64,2%

đột biến EGFR với giới tính (p = 0,41), độ tuổi (p
= 0,73) và tiền sử hút thuốc (p = 0,09) (Bảng 2).
Theo nghiên cứu của Sun PL và cộng sự ghi
nhận năm 2012 thì tỷ lệ đột biến ở nữ và nam lần
lượt là 65.7% và 34.3%. Các tác giả cũng ghi nhận
đột biến EGFR ở nhóm không hút thuốc cao hơn
nhóm hút thuốc (lần lượt là 63,4% và 32%)(24).
Mối liên quan giữa đột biến EGFR và tiền sử hút
thuốc cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của
tác giả Phạm Duy Khánh và cộng sự vào năm
2006. Nghiên cứu của tác giả Phạm Duy Khánh
được thực hiện trên 265 bệnh nhân ung thư phổi
tại Mỹ với tỷ lệ đột biến gen EGFR là 25%. Trong
đó, đột biến EGFR được xác định ở người không
hút thuốc là 51%, người từng hút thuốc là 19%
và người đang hút thuốc là 4%(18). Tác giả Yoon
Hee Choi và cộng sự cũng ghi nhận trong
nghiên cứu chỉ có 39% bệnh nhân trẻ hơn 57 có
đột biến EGFR, trong khi con số này ở bệnh nhân
trên 65 tuổi 69%, vì vậy tuổi càng cao thì tỷ lệ đột
biến gen EGFR cũng tăng theo(3).
Trong những đột biến được phát hiện, đột
biến mất đoạn ở exon 19 chiếm tỷ lệ cao nhất
(25/43 trường hợp, 58,1%) (Bảng 1). Đây là đột
biến xóa đoạn điển hình xảy ra tại chuỗi ELREA
ở exon 19 của gen EGFR (Hình 1A). Kế đến là
đột biến L858R trên exon 21 (13/43 trường hợp,
30,2%) (Bảng 1). Đây là đột biến thay thế một
nucleotid xảy ra ở codon 858 thuộc exon 21 của
gen EGFR (Hình 1B). Điều này cho thấy nhóm

(như AZD9291 hoặc CO1686) cho ra kết quả khá
khả quan trong việc làm giảm tính kháng thuốc
của đột biến T790M (10, 20). Thêm vào đó, sự phối
hợp thuốc afatinib (một EGFR-TKI thế hệ 2) và
cetuximab (kháng thể kháng EGFR) cũng cho
thấy những tín hiệu tốt trong việc ức chế thể
EGFR có đột biến T790M (6, 9). Tuy nhiên, phương
pháp kiểm soát bệnh cụ thể cho các trường hợp
kháng TKIs của bệnh nhân UTPKTBN có đột
biến EGFR vẫn chưa được khuyến cáo chính
thức vì chưa có kết quả đầy đủ và chuyên sâu từ
các nghiên cứu lâm sàng đang tiến hành. Trong
những đột biến được phát hiện, hai dạng đột
biến G719S tại exon 18 và L861Q tại exon 21
chiếm tỷ lệ rất nhỏ 2,3% (1/43 ca cho mỗi loại)
(Bảng 1). Tại vị trí nucleotid 2155 trên exon 21, G
bị biến đổi thành A, làm cho acid amin Glycine
(G) tại codon 718 biến đổi thành Serine (S), gây
nên đột biến G719S. Ở đột biến L861Q, T bị biến
đổi thành A tại vị trí nucleotid 2582 trên exon 21,
làm cho acid amin Leucine (L) tại codon 861 biến
đổi thành Glutamine (Q). Ngoài ra, chúng tôi còn
ghi nhận có 5 ca tồn tại 2 đột biến cùng lúc, bao

110

gồm 1 ca chứa đột biến T790M - L858R, 1 ca chứa
đột biến T790M - Deletions, 2 ca đột biến
Deletions - L858R và 1 ca đột biến Deletions T790M (Bảng 1).


7.

8.

Ahmadian A, Ehn M and Hober S (2006). Pyrosequencing:
history, biochemistry and future. Clinica Chimica Acta. 363(12):83-94.
Boch C, Kollmeier J, Roth A et al (2013). The frequency of
EGFR and KRAS mutations in non-small cell lung cancer
(NSCLC): routine screening data for central Europe from a
cohort study. BMJ Open. 3:e002560.
Choi YH et al (2010). Association between age at diagnosis
and the presence of EGFR mutations in female patients with
resected non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 5(12):19491952.
Ebert W, Dienemann H, Fatech-Moghadam A et al (1994).
Cytokeratin 19 fragment CYFRA 21-1 compared with
carcinoembryonic antigen, squamous cell carcinoma antigen
and neuro specific enolase in lung cancer. Results of an
international multicenter study. Eur J Clin Chem Clin Biochem.
32(3):189-99.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM
(2010). Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:
GLOBOCAN 2008. Int J Cancer. 127(12):2893-917.
Gomes JR, Cruz MR (2015). Combination of afatinib with
cetuximab in patients with EGFR-mutant non-small-cell lung
cancer resistant to EGFR inhibitors. Onco Targets Ther. 8: 1137–
1142
Hoàng Anh Vũ, et al. (2011). Đột biến gen EGFR và KRAS
trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Y học TP. Hồ
Chí Minh Chuyên đề Điều dưỡng Kỹ thuật Y học, PB Tập
17(4):165-171.

mutations. Cancer Discov. 4(9):1036-45.
Janne PA, Yang JC, Kim DW et al. (2015). AZD9291 in EGFR
inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med.
372(18):1689-99.
McDonald M, Hertz RP, Lowenthal SWP (2008). The burden
of cancer in Asia. Pfixer Inc.
Mok TS, Wu YL, Thongprasert S et al (2009). Gefitinib or
carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Eng J
Med. 361(10), 947-958.
Nguyễn Minh Hà (2013). Xác định đột biến gen EGFR ở bệnh
nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Y học TP. Hồ Chí Minh,
Tập 17, Số 1, pp 34-37.
Ogino S, Kawasaki T, Brahmandam M, et al. (2005). Sensitive
sequencing method for KRAS mutation detection by
pyrosequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 7(3):413421
Pao W, Miller VA (2005). Epidermal growth factor receptor
mutations, small-molecule kinase inhibitors, and non-smallcell lung cancer: current knowledge and future directions. J
Clin Oncol. 23(11),.2556-2568.
Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P (2005). Global cancer
statistic. CA Cancer J Clin. 55(2): 74-108.
Peto R, Doll R (1978). Cigarette smoking and bronchial
carcinoma: dose and time relationships among regular
smokers and lifelong non-smoker. J Epidemiol Community
Health. 32(4):303-13.
Pham DK, Kris MG, Riely GJ et al (2006). Use of cigarettesmoking history to estimate the likelihood of mutations in

Hô Hấp

19.
20.

frequency of mutation of epidermal growth factor receptor in
lung adenocarcinoma in Thailand. Cancer Lett. 239(2):292-7.
Sun PL, Seol H, Lee HJ et al (2012). High incidence of EGFR
mutations in Korean men smokers with no intratumoral
heterogeneity of lung adenocarcinomas. Journal of Thoracic
Oncology. 7(2):324-330.
Wu K, House L, Liu W, Cho WC (2012). Personalized targeted
therapy for lung cancer. Int J Mol Sci. 13(9):11471–11496.

Ngày nhận bài báo:

20/11/2015

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

30/11/2015

Ngày bài báo được đăng:

15/02/2016

111