ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
CLS
Bình phương tối thiểu thông thường (classical least
square)
ILS
Bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least square)
PLS
Bình phương tối thiểu từng phần (partial least square)
PC
Cấu tử chính (Principal component)
UI
EtOH
Đơn vị quốc tế chuẩn hóa
(international unit)
Ethanol
KLTB
Khối lượng trung bình viên
PCR
axetonitril
AMP
Ampicillin
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
MỞ ĐẦU
Hiện nay hoạt động sản xuất và buôn bán kháng sinh nói riêng và tân
dược nói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ khiến một số tổ chức, cá
nhân đã tung ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày. Thuốc giả không
chỉ đánh lừa người tiêu dùng, còn vô hiệu hóa các liệu pháp điều trị để cứu sống
bệnh nhân và trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại to lớn như gây
ra các phản ứng dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh nhân dễ
kháng thuốc. Đại diện tổ chức Y Tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7
15% tổng số thuốc ở các nước phát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong
đó các nước ở khu vực Châu Á chiếm 50%. Các mẫu thuốc giả thường được
phát hiện chủ yếu là các loại kháng sinh như Ampicillin, Penicillin…Điều khiến
nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam ngày càng một gia tăng và
diễn biến trở nên phức tạp hơn dẫn đến công tác kiểm tra khó khăn hơn.
Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc đúng hoạt chất, và đúng hàm lượng hoạt
chất trong thuốc là một vấn đề hết sức cấp thiết. Hiện nay có rất nhiều phương
pháp xác định hàm lượng kháng sinh hiệu quả cao như phương pháp sắc ký lỏng
hóa học chứa vòng βlactam. Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽ
hình thành các phân nhóm lớn tiếp theo.
Cáckháng sinh βlactam được chia thành 4 nhóm gồm các penicillin tự
nhiên và tổng hợp,cáccephalosporin bán tổng hợp,các chấtcarbapenem,
monobactam.Trong đó có hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất là nhóm các
penicillin và cephalosporin.
Các penicillin và cephalosporin tự nhiên được chiết tách từ môi trường
nuôi cây nấm penicilium notaum mà nay gọi là penicillin chrysogenum và
cephalosporium aeremonium [2].
1.1.1.1. Nhóm penicillin
Nguồn gốc: Lexander Fleming (1929) phát hiện môi trường nuôi cấy penicillium
notatum, P. chysogenum.Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin
được đưa ra trong bảng 1.1.
Chuyên ngành hóa phân tích 10 Trường
ĐHKHTN
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
Bảng1.1. Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin.
Kháng sinh thuộc họ penicillin có cấu trúc mạch vòng beta lactam (amin nội
vòng) gắn với mạch ngang RCONH, được gọi là các amin của 6Amino
penicillanie (A.6.A.P) có công thức chung R – C9H11N2O4S [4,7].
Tính chất: Là chất bột màu trắng, dễ bị phá hủy trong môi trường oxi hóa, môi
trường có tính kiềm và nhiệt độ cao, hoặc do tác dụng của nước, của men
penicillin naza (do vi khuẩn đường ruột hay vi khuẩn Gr () sinh ra.
Phân loại:
phổ kháng khuẩn giống aminopenicilin nhưng rộng hơn.
Gồm các thuốc azlocilin, mezlocilin, piperacilin có phổ kháng khuẩn
giống carboxypenicilin cộng thêm Klebsiella và một số vi khuẩn Gr ()
khác.
1.1.1.2.Nhóm cephalosporin
Chuyên ngành hóa phân tích 12 Trường
ĐHKHTN
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
Nguồn gốc:
Cephalosporin trong tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporin acremonium có hoạt tính kháng khuẩn thấp nên không được dùng
trong lâm sàng. Các cephalosporin hiện đang dùng là các chất bán tổng hợp từ 7
aminocephalosporinic (7ACA).Cấu trúc vòng 7ACA cũng dễ bị cephalosporinase
phá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn.
Cấu trúc chung gồm vòng β lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh.
Khi thay đổi các gốc R được các cephalosporin có độ bền,tính kháng khuẩn và
dược động học khác nhau.
Công thức hóa học:
Cấu trúc hóa học của các kháng sinh nhóm cephalosporin đều là dẫn xuất của
Axit 7aminocephalosporanic (viết tắt là A7AC). Các cephalosporin khác nhau
được hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp.Cấu trúc chung gồm vòng β
lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh. Khi thay đổi các gốc R1, R2 được các
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
Thế hệ
Tên thuốc
Cefazolin
Cephalosporin thê h
́ ẹ 1
̂
Cephalexin
Cefadroxil
Cefoxitin
Cefaclor
Cephalosporin thê h
́ ẹ 2
̂
cefafrozil
cefuroxim
cefotetan
ceforanid
Cefotaxim
Cefpodoxim
Ceftibuten
Cefdinir
Cefditoren
Khang sinh monobatam la khang sinh ma cong th
́
̀ ́
̀ ̂
ưc phan t
́
̂ ử co ch
́ ưa
́ βlactam
đon vong.Chât điên hinh cua nhom nay la aztreonam.
̛
̀
́ ̉
̀
̉
́
̀ ̀
1.1.2.Tính chất vật lývà hóa học các kháng sinh nhóm β Lactam
Các β Lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong
nước, dạng muối natri và kali dễ tan, tan được trong metanol và một số dung môi
hữu cơ có độ phân cực vừa phải, tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa
phần chứa đồng thời nhóm COOH và –NH2.
Cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy thuộc vào cấu trúc khác làm
dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài,
giảm độ hấp thụ).
Tính chất hóa học các kháng sinh nhóm β Lactam
Tính không bền của vòng βlactam:
Sự tấn công của các tác nhân thân điện tử (An): Các bazơ mở vòng azetidin
2on, tạo ra những dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính sinh học
[5].
1.2.
Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β lactam.
1.2.1. Phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang…Các
phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi
xác định βlactam, đặc biệt trong dược phẩm [8 ].
Các βlactam hấp thụ các tia UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ.
Chúng tạo thành phức chất với một số ion kim loại hoặc tham gia phản ứng
quang hóa giúp nâng cao độ nhạy của phép đo.
Chuyên ngành hóa phân tích 18 Trường
ĐHKHTN
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 514790 đã qui định phương pháp gián tiếp sử
dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và
sản
phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này
dựa vào phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với
thuốc
thử
ứng trong dung dịch lọc tại bước sóng 358,6 nm. Theo định luật Lambert – Beer
cho nghiên cứu các mẫu thuốc trong khoảng 0,11,5 mg mL1 cho phổ quang kế và
570 μg mL1 cho phương pháp AAS, hệ số tương quan ≥ 0,9965. Cả hai phương
pháp đều có độ chính xác khi phân tích các cephalosporins trong các mẫu thuốc và
đều cho phần trăm độ thu hồi tốt từ 98,90 ± 0,94 đến 100,15 ± 0,97 mà không cần
thêm phụ gia.
1.2.2. Các phương pháp sắc ký
Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 1972004 qui định phương pháp định lượng
Penicillin [13] trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch
đệm phosphat, pH= 9, làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn
xuất hoá và định lượng bằng HPLC với detector PDA. Qui trình này trải qua quá
trình dẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản.
TitusA.M.Msagati và cộng sự [4] đã xác định lượng dư các βlactam trong
thực phẩm bằng sắc ký lỏng – khối phổ bằng hỗn hợp đệm phosphat,
tetraetylammoniumclorua (Et4NCl) và acetonitril.Sau đó, các βlactam sẽ được
tách và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LCPIESI
MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với penicillin G và penicillin V
trong gan và bầu dục là là 1 ng/kg, trong sữa là 0,7 µg/l.
Helio A.MartinsJúnior [25] cũng đã sử dụng phương pháp LC/MS để xác
định lượng dư kháng sinh có trong sữa. Mục đích của nghiên cứu này nhằm phát
triển một phương pháp phân tích mới đơn giản và nhanh chóng để xác định và
định lượng mười bốn kháng sinh từ các mẫu sữa khác nhau .Trong đó, có năm β
lactam, bốn sulfonamides, ba tetracycline, một macrolid và một cephalosporin. Các
chất này đều được xác định trong khoảng nồng độ 0,753,75 mg L 1, hệ số tuyến
tính (r2) cao hơn 0,9960, với thời gian phân tích ít hơn 10 phút. Giới hạn định
Chuyên ngành hóa phân tích 20 Trường
ĐHKHTN
Chuyên ngành hóa phân tích 21 Trường
ĐHKHTN
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
J.M.Cha và các cộng sự [27] cũng đã dùng phương pháp HPLC – MS để xác
định lượng vết của thuốc kháng sinh βlactam trong mẫu nước tự nhiên và nước
thải. Mẫu nước được làm giàu bằng chiết pha rắn, cột Xterra MS C18 (2,1mm x
50mm,; 2,5 µm), pha động gồm axit focmic,metanol và acetonitil. Các chất phân
tích bao gồm amoxicillin (AMOX), ampicillin (AMP), oxacillin (OXA), cloxacillin
(ClOx) và cephapirin (CEP). Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu thường
trên 75% (trừ amoxicillin) với độ lệch chuẩn thấp hơn 10% trong các mẫu nước.
Amoxicillin có hiệu suất thu hồi kém (dưới 40%). Giới hạn phát hiện phương
pháp (MDL) được ước tính khoảng từ 8 10 ng/L với nước bề mặt, 13 18 ng / L
với nước thải trước xử lý và 8 15 ng / L nước thải sau xử lý của một nhà máy
xử lý nước thải.
Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments cùng các cộng sự [19] đã
sử dụng phương pháp HPLC để xác định 8 hợp chất penicillin (benzylpenicillin,
phenoxymethylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, nafcillin, oxacillin, cloxacillin, và
dicloxacillin) ở mức lượng vết trong các mô cơ. Các điều kiện chiết các
penicillin với đệm phosphat có pH = 9 sau khi chiết bằng cột chiết tách pha rắn
C18, phản ứng với anhydrit benzoic ở 500C trong 5 phút và với 1,2,4triazol, dung
dịch thủy ngân (II ) clorua có pH = 9 ở 650C trong 10 phút. Các hợp chất dẫn xuất
được tách rửa trên một cột C18 với pha động chứa acetonitril và đệm phosphat
(pH=6; 0,1 mol/L) được nạp với natri thiosunfat và cặp ion tetrabutylammonium
hydro sunfat. Giới hạn phát hiện phương pháp là khoảng 311 µg/l.
1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại
1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR
sẽ bị mất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị hấp thụ.
*Các vùng phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại thường được ghi với trục tung biểu diễn độ truyền qua T
hoặc độ hấp thụ A, trục hoành biểu diễn số sóng (cm1).
Độ truyền qua T: là tỷ số của cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ
tới.
Chuyên ngành hóa phân tích 23 Trường
ĐHKHTN
Luận văn Thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Ánh Tuyết K23 Hóa
Học
Độ hấp thụ ánh sáng (A): là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền quang.
Bức xạ hồng ngoại là một vùng bức xạ điện từ có độ dài bước sóng từ 0,8 đến
1000µm và chia thành ba vùng:
Vùng hồng ngoại gần (near infrared): 125004000 cm1 (λ = 0,8–2,5µm)
Vùng hồng ngoại trung (medium infrared): 4000400 cm1 (λ = 2,5–50µm)
Vùng hồng ngoại xa (far infrared): 40010 cm1 (λ = 50100µm).
Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000
650cm1.
1. Vùng hồng ngoại gần (NIR):
Trong vùng 12500 cm 1 4000 cm1 có rất nhiều đám phổ có liên quan đến
nguyên tử H. Trong số đó, dao động co giãn (bội) của OH gần 7140 cm 1 và NH
gần 6667 cm1, đám phổ tổ hợp do các dao động co giãn và dao động biến dạng
của CH của nhóm ankyl ở 1548 cm1 và 3856 cm1..
Độ hấp thụ của đám phổ NIR thấp hơn từ 10 đến1000 lần so với các đám
phổ vùng hồng ngoại giữa.Vùng NIR có thể ghi được với hệ quang học thạch
anh, kết nối với các detectơ nhạy với NIR và nguồn bức xạ mạnh hơn.
19 và các dao động biến dạng trong hệ thống mạch vòng
hoặc chưa no. Vùng dao động tần số thấp trong phổ hồng ngoại rất nhạy đối với
sự thay đổi cấu trúc phân tử, bởi vậy đám phổ vùng hồng ngoại xa thường cho
phép dự đoán các dạng đồng phân.
1.2.3.2. Cách chuẩn bị mẫu đo hồng ngoại
Một trong các lợi thế vượt trội của phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) là
có thể phân tích được hầu hết các dạng vật chất như: chất lỏng, dung dịch, bột
nhão, bột khô, phim, sợi, khí và các bề mặt…
Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm
toàn phần trong đó kỹ thuật truyền qua được sử dụng nhiều nhất.
Phổ FTIR của các hợp chất có thể được ghi ở pha hơi, pha lỏng hay ở pha
Copyright: Tài liệu đại học ©