Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

M

U

Cá tra hi n đang đóng vai trò quan tr ng trong xu t kh u th y s n c a Vi t
Nam. N m 2011, đã có h n 230 doanh nghi p xu t kh u cá tra đ n h n 130 th
tr ng trên th gi i, đ t 1,8 t USD, t ng g n 26,5%, v i kh i l ng trên 600 nghìn
t n, t ng 3% so v i n m 2010 [3].
Tuy nhiên, vi c m r ng di n tích thâm canh và nuôi tr ng cá tra v i m t đ
cao mà ch a có bi n pháp qu n lý phù h p đã làm cho d ch b nh bùng n gây thi t
h i không nh cho ng i dân. M t trong nh ng b nh đ c đánh giá là nguy hi m
trên cá tra là b nh gan th n m do tác nhân vi khu n Edwardsiella ictaluri gây nên
gây ch t cá v i s l ng l n. Tr c đây, th i k cao đi m c a d ch b nh th ng
vào tháng 9 đ n tháng 12, nh ng hi n nay, d ch b nh đã x y ra quanh n m. T c đ
lây lan t l thu n v i m c đ thâm canh, m t đ nuôi cá trên m t đ n v di n tích
ao nuôi. T l cá ch t có th lên t i 90% cá tra gi ng, 50% cá tra th

ng ph m [4].

Hi n nay, vi khu n E. ictaluri đã đ kháng v i nhi u lo i kháng sinh, m t
khác ch a có vaccine phòng b nh gan th n m m t cách hi u qu nên vi c xác đ nh
s m tác nhân gây b nh đóng vai trò quan tr ng trong vi c phòng ch ng, ki m soát
và đi u tr b nh cho cá. Thông th ng, đ phát hi n m t tác nhân gây b nh b ng
ph

ng pháp vi sinh v t trong phòng thí nghi m m t kho ng 7 ngày v i đ tin c y


CH

K53B-CNSH

NG 1: T NG QUAN TẨI LI U

1.1. VI KHU N Edwardsiella ictaluri
1.1.1.
c đi m sinh h c vƠ đ c đi m h gen
Edwardsiella m t trong nh ng chi m i c a h Enterobacteriaceae đ c đ t
tên theo tên nhà bác h c ng i M P.R. Edwards (1901–1966) ng i đ u tiên đã
phân l p và phân lo i đ c vi khu n này. Chi Edwardsiella g m 3 loài:
Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae trong đó E.tarda
và E. ictaluri đ

c xem là nh ng đ i t

ng gây b nh ch y u trên cá da tr n. Khác

v i E. tarda có kh n ng gây b nh c trên đ ng v t và ng i thì vi khu n E. ictaluri
ch tìm th y trên các loài đ ng v t máu l nh đ c bi t là trong môi tr ng n c ng t.
Các đ c đi m sinh hóa c a vi khu n E. ictaluri sai khác v i E. tarda m t s đ c
tính nh không sinh H2S, không sinh indole, di đ ng 25ºC và không di đ ng
37ºC.
Vi khu n thu c chi Edwardsiella mang các đ c đi m đi n hình c a h
Enterobacteriaceae: vi khu n Gram âm, hình que th ng, nh , kích th c 1×2-3 µm,
không hình thành bào t và di đ ng b ng tiên mao, hô h p k khí tùy ti n. Kích
th c khu n l c trên môi tr ng c s sau 24 gi nuôi c y r t nh (0,5-1 mm) [8].



c 1 mm. V m t sinh hóa, E.

ictaluri c ng ít ho t tính h n so v i các loài Edwardsiella khác [8].
Genome c a E. ictaluri là m t nhi m s c th đ n d ng vòng, có kích th

c

kho ng 2,15 Mb. Nghiên c u DNA ch ra r ng E. ictaluri liên quan ch t ch nh t
đ n E. tarda. Trong h gen c a E. ictaluri thì h gen eip là đ c tr ng ch có loài
E. ictaluri. H gen này bao g m 11 gen trong đó 8 gen xác đ nh mã hóa cho protein.
Trong s này có 3 gen l n l t là eip18, eip19, eip20 mã hóa cho các s n ph m
protein v i tr ng l ng kho ng 18, 19 và 20 kDa. Theo Moore và c ng s (2002)
thì gen eip18 đ c bi u hi n trong quá trình nhi m b nh và đóng vai trò là kháng
nguyên gây đáp ng mi n d ch [17]. Do h gen này mang tính đ c tr ng cho loài
nên có th s d ng m t trong s 3 gen này đ phân l p đ n loài b ng ph ng pháp
sinh h c phân t . Hi n nay, gen eip18 là gen đ c dùng nhi u trong các nghiên c u
đ phát hi n, đ nh danh vi khu n E. ictaluri, tác nhân gây b nh nhi m trùng huy t
trên cá da tr n M [31].
1.1.2. Tình hình b nh d ch
E. ictaluri đ

c phát hi n là tác nhân gây b nh gan th n m

cá da tr n

(Ictalurus punctatus) nuôi các bang ông nam M b i Hawke n m 1981[10]. Cá
th ng b nhi m b nh vào các tháng cu i n m khi nhi t đ n c h th p (kho ng t
tháng 9 đ n tháng 1 n m sau). Tuy nhiên, hi n nay do m r ng di n tích nuôi tr ng
và ki m soát d ch không t t d n đ n vi c d ch b nh di n ra quanh n m.

Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
Khi cá b b nh ng

i nuôi th

K53B-CNSH
ng dùng ch t hoá h c và thu c kháng sinh đ

ch a tr , tuy nhiên do s d ng b a bãi, vi khu n E. ictaluri trên cá tra đã kháng v i
m t s lo i thu c kháng sinh nh : Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [1];
Amoxicilin và Ampicilin [5]. Vi c s d ng kháng sinh còn làm cho các s n ph m
th y s n sau đó th ng không đ c a chu ng do s tích l y thu c, hoá ch t trong
th t.
Nh v y b nh gan th n m đ c đánh giá là m t trong nh ng b nh gây t n
th t l n cho ngành nuôi tr ng th y s n, đ c bi t là cá tra và cá basa c a n c ta.
Vi c phân l p đ xác đ nh chính xác tác nhân gây b nh là r t c n thi t đ ng i nuôi
tr ng th y s n có th phòng và tr b nh.
1.2. CÁC PH
NG PHÁP PHÁT HI N VI KHU N E. ictaluri
1.2.1. Ph ng pháp truy n th ng
1.2.1.1. Ph ng pháp vi sinh
Ph ng pháp phân l p là m t trong các ph

ng pháp c b n dùng đ phát

hi n vi khu n. M u b nh ph m sau khi thu nh n đ c nuôi c y trên môi tr ng
ch n l c riêng dành cho vi khu n E. ictaluri là EIM (Edwardsiella ictaluri
medium). Vi khu n phát tri n trên EIM đ c phân bi t v i E. ictaluri d a trên hình
thái c a khu n l c. EIM c ch vi khu n Gr (+) ngo i tr c u khu n (Enterococci).

1.2.2.1. Phân lo i d a vào 16S rDNA
Vi c s d ng các trình t gen mã hóa 16S rRNA đ nghiên c u phát sinh loài
vi khu n và phân lo i đã đ c s d ng r t ph bi n. Gen mã hóa 16S rRNA t n t i
nh m t h đa gen ho c operon; ch c n ng c a gen mã hóa 16S rRNA không thay
đ i theo th i gian cho th y s thay đ i th t ng u nhiên là m t th c đo chính xác
trong quá trình ti n hóa và gen 16S rRNA có kích th c kho ng 1500 bp là đ l n
cho các m c đích thông th ng dùng trong phân lo i c p đ phân t [21].
i v i hai loài E. ictaluri và E. tarda, sau khi s d ng PCR nhân trình t
16S rDNA, đ c trình t cho th y đ t ng đ ng rDNA c a hai loài lên t i 99,6%
[5] và c ng ch có th k t lu n tác nhân gây b nh thu c chi Edwardsiella.
Nh v y k t h p ph

ng pháp truy n th ng và ph

vào 16S rDNA có th phát hi n đ
c ng khá dài, lên đ n 7 ngày.

ng pháp phân lo i d a

c E. ictaluri song t ng th i gian nghiên c u

1.2.2.2. Phân lo i d a vào gen đ c tr ng
Gen eip18 là m t trong ba gen đ c tr ng ch có

E. ictaluri mà không có

E. tarda, cho nên nó đ c xem là m t trong nh ng ch th phân t đ xác đ nh chính
xác đ n c p đ loài. Vì v y đ ki m tra xem ch ng vi khu n nào có ch a đo n gen
đó có th s d ng ph ng pháp PCR v i c p m i là eip18 nh m nhân s l ng l n
gen eip18 đ i v i nh ng ch ng có đo n gen này. Sau khi khu ch đ i, s n ph m

kho ng 60 phút. S n ph m cu i cùng nh n đ

c là các đo n DNA d ng g p khúc có

kích th c g p nhi u l n kích th c c a đo n gen đích. DNA polymerase th ng
đ c s d ng trong các ph n ng LAMP là Bst DNA polymerase ho c Bsm
polymerase. Ph ng pháp LAMP r t nh y, có th thu đ c k t qu t t ngay n ng
đ DNA th p [31]. Tuy nhiên, m i dùng cho ph n ng LAMP l i ph c t p h n m i
cho ph n ng PCR thông th ng. Ph n ng LAMP c n ph i s d ng ít nh t hai c p
m i, m t c p có chi u dài 40 nucleotide và đ c thi t k đ c bi t, c p còn l i có
chi u dài kho ng 20 nucleotide. Do đó, đ đ c hi u c a ph n ng cao h n nhi u so
v i ph ng pháp PCR.
Nh ng u đi m c a ph

ng pháp LAMP so v i ph

ng pháp PCR:

- Không đòi h i máy bi n nhi t đ t ti n nh PCR b i vì t t c ph n ng di n
ra t i 1 nhi t đ c đ nh. Do v y ch c n m t máy n nhi t đ n gi n c a phòng thí
nghi m bình th

ng.

- K t qu có th đ

c đ c ngay sau khi ph n ng k t thúc mà không c n

đi n di trên gel agarose d a vào s t o thành Mg2P2O7 k t t a là s n ph m ph c a
ph n ng khu ch đ i gen có th đ c xác đ nh b ng ly tâm ho c đo đ đ c. Ho c

DNA đi u ki n đ ng nhi t có s t o thành các vòng loop trên phân t s n ph m
d i s h tr c a enzyme có ho t tính t tách chu i cao và s có m t c a các m i
đ c hi u.
1.2.3.2. M i cho ph n ng LAMP
Ph n ng LAMP c n ít nh t 4 m i: c p m i ngoài F3, B3 có vai trò trong
vi c chuy n m ch nên ch tham gia vào giai đo n đ u c a ph n ng; c p m i trong
6
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

FIP, BIP là m i lai ch a c trình t khuôn và đ i khuôn giúp cho vi c hình thành
vòng loop.
M i ngoài ng

c B3 b sung v i B3c c a DNA, m i ngoài xuôi F3 b sung

v i F3c c a DNA. M i trong xuôi FIP g m F1c đ u 5’ gi ng trình t F1c trên
DNA đích và F2 đ u 3’ b sung v i F2c DNA đích, t ng t m i trong ng c
BIP g m B1c đ u 5’ có trình t gi ng B1c DNA đích và B2 đ u 3’ có trình t
b sung v i vùng B2c

DNA đích.

Hình 2: M i cho ph n ng LAMP
6 vùng khác bi t trên s i DNA khuôn đ c kí hi u là F3, F2, F1, B1c, B2c và B3

bp, kho ng cách gi a 2 đo n trong F2-F3 và B2-B3 t 0 đ n 20 bp. Kho ng cách
trong vùng t o loop (t đ u 5’ c a F2 t i 3’ F1 và 5’ B2 đ n 3’ B1) kho ng 4060bp.
- Chi u dài c a trình t DNA khu ch đ i (t F2 đ n B2) không nên l n h n
200bp.
tinh khi t c a m i là r t quan tr ng đ kh n ng tái khu ch đ i nhanh
chóng.
- N u trên gen đích ho c trên vùng ch a primer có v trí c t c a enzyme gi i
h n thì có th đ

c s d ng đ xác đ nh chính xác s n ph m khu ch đ i.

1.2.3.3. Nguyên lý c a ph ng pháp LAMP
LAMP là m t quá trình t ng h p DNA t đ ng đ

c th c hi n

m t nhi t

đ không đ i t 60-65ºC trong kho ng th i gian 45-60 phút v i s có m t c a Bst
DNA polymerase, dNTP, v i ít nh t 4 m i đ c thi t k b sung v i 6 trình t riêng
bi t trên gen đích. Có hai b c khu ch đ i LAMP là b c không theo chu k và
b c theo chu k [22].
- B c không theo chu k : m c tiêu là t o ra s i DNA có hai vòng loop hai
đ u, là c u trúc kh i đ u cho b

c LAMP theo chu k . V i ph

ng pháp LAMP,

không gi ng nh PCR, không c n có s bi n tính DNA s i đôi b i nhi t đ . Thông

và g n vào v trí F3c trên DNA khuôn, m t s i m i đ c t ng h p t m i F3 và thay th
cho s i t ng h p b i m i FIP. S i đ n t ng h p b ng m i FIP s b đ y ra và hình thành
nên m t c u trúc loop đ u 3’ c a nó (c u trúc 3). Quá trình s đ c ti p di n v i m i BIP
và m i B3. Cu i cùng m t s i đ n có c u trúc loop c hai đ u 3’ và 5’ đ c hình thành
(c u trúc 5).

- Khu ch đ i theo chu k : trong chu k LAMP, m i trong liên k t b sung
v i đo n loop trong s n ph m và b t đ u t ng h p s i DNA thay th , t o ra s i
DNA loop m i v i chi u dài g p đôi. Trong th i gian ng n, m i FIP liên k t v i
đo n loop c a s i đ n g c, t ng h p s i DNA thay th , phát hành s i t ng h p
tr c đó t o ra s i đ n có c u trúc loop đ u 3’ vì liên k t b sung gi a B1c và B1.
Sau đó, b t đ u t đ u 3’ c a B1, s t ng h p DNA b t đ u b ng cách s d ng c u
trúc c a b n thân nh là khuôn và gi i phóng s i b sung liên k t v i FIP, s i đ n
này có c u trúc gi ng qu t v i loop hai đ u do b sung gi a F1-F1c, B1-B1c.
H n n a, BIP liên k t v i B2c t ng h p s i thay th , gi i phóng s i DNA m i b i
B1. K t qu là t o ra các c u trúc có kích th c khác nhau, g m các trình t l p l i
luân phiên đ o ng c c a trình t đích trên các s i m i đ c t o thành. Ph n ng
theo chu k ti p t c v i s tích l y c a 109 b n sao c a DNA đích trong vòng ch a
đ y 1 gi .

9
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

S n ph m cu i cùng là các DNA m ch đôi có c u trúc g n gi ng súp l v i


trên nhi m s c th c a Bacillus stearothermophillus. Bst DNA polymerase là m t
DNA polymerase có ho t tính 5’-3’ polymerase và ho t tính t tách chu i cao
nh ng l i thi u ho t tính 3’-5’ exonuclease. Bst DNA polymerase có đ ho t đ ng
r t cao, ho t đ ng nhi t đ t i u 60ºC- 65ºC. B b t ho t nhi t đ l n h n
70ºC. Nó v a có kh n ng tách chu i, v a có kh n ng t ng h p chu i m i. Do đó
10
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
trong quá trình khu ch đ i DNA không c n thêm b

K53B-CNSH
c bi n tính DNA

nhi t đ

cao [16].
1.2.3.6. Betaine ( N,N,N- trimethylglycerine)
Trong các h th ng sinh h c, betaine ho t đ ng nh m t ch t đ c t bào t
t ng h p ho c l y t môi tr ng bên ngoài đ ch ng l i áp l c th m th u, h n hán,
đ m n cao ho c nhi t đ cao. Khi betaine tích t trong c th , nó giúp n đ nh c u
trúc b c 4 c a protein, n đ nh ch c n ng c a enzyme, n đ nh tính toàn v n c a
màng, cho phép gi n c trong t bào, do đó b o v t bào kh i nh ng nh h ng
c a s m t n c [32].
Glyceryl betaine (N,N,N- trimethylglycerine) là betaine đ c phát hi n đ u
tiên trong c c i đ ng th k 19. Tuy nhiên, đ i v i DNA thì betaine là ch t hóa
h c gây m t n đ nh xo n c a DNA (có th làm gi m s hình thành c u trúc th

Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

quá trình khu ch đ i DNA nh DNA polymerase đi cùng v i vi c t o ra magie
pyrophosphate (Mg2P2O7), đ c t o ra do k t qu c a s k t h p gi a ion
pyrophosphate t o ra t nguyên li u dNTP và Mg2+ trong dung d ch ph n ng. M t
l ng l n DNA cao đ c t ng h p t ph n ng LAMP d n đ n đ ng th i s n xu t
m t l ng l n ion pyrophosphate. Ion pyrophosphate liên k t c c m nh v i các ion
kim lo i khác t o mu i không tan và có th quan sát đ c b ng m t th ng. Tuy
nhiên, các tín hi u này khá y u nên m t th ng khó phát hi n.
đ t hi u qu cao
h n, s n ph m khu ch đ i trong ng còn đ c phát hi n b ng cách nhu m tr c ti p
DNA s i đôi nh các thu c nhu m nh SYBR Green, PicoGreen…[18], trong đó
đ n gi n và d s d ng nh t là SYBR Green ho c phát hi n hu nh quang gián ti p
s n ph m LAMP trong ng nh vào s n ph m ph pyrophosphate b ng vi c s
d ng Calcein.
1.3.2. S d ng SYBR Green I
SYBR Green I k t h p v i DNA s i đôi thì phát quang, vì v y khi s n ph m
càng tích l y thì tín hi u hu nh quang càng t ng lên. Nh ng l i th c a SYBR
Green I là d s d ng và nh y c m. i m b t l i là SYBR Green I s ph n ng liên
k t v i b t kì DNA s i đôi nào, bao g m c dimer do m i sinh ra và các s n ph m
ph n ng không đ c hi u khác.

Hình 6: S ho t đ ng phát quang c a SYRB Green
M t khác, n u thêm SYBR Green I tr c ph n ng, do đ c tính liên k t ch t
v i DNA đôi, nó có th gây c ch ph n ng, nh ng n u m n p đ thêm SYBR
Green I vào sau khi ph n ng k t thúc l i gây ra nguy c ô nhi m chéo. Và cu i
cùng, SYBR Green I là hóa ch t đ t ti n khó đ c ng d ng m t cách r ng rãi nh

pKa3 = 11,3. Calcein phát x quang h c

b

c sóng ánh sáng t 495 đ n 515 nm

và c c đ i b c sóng 509 nm t i pH 7.4. S thay đ i màu s c c a ch th kim lo i
này có th đ c quan sát b ng m t th ng ho c d i tia UV. S phát quang c a
Calcein đ c d p t t b i các ion kim lo i nh Co2+, Ni2+ và Cu 2 +, Fe3+ và Mn2+.
Tuy nhiên, Calcein t o thành m t h p ch t phát hu nh quang m nh v i các kim lo i
ki m th [34].
Hi n nay s n ph m th ng m i ch a Calcein đang đ c s d ng ph bi n là
FDR (Flourescent dectection reagent) do công ty Eiken c a Nh t cung c p.
1.3.3.2. S phát quang c a Calcein
G n đây, Tomita và c ng s n m 2008 đã báo cáo m t ph n ng LAMP
đ c phát hi n b ng cách thêm Calcein và ion Mn2+ vào ph n ng. Calcein không
đ c h i nh nh ng thu c th hu nh quang khác nh SYBR Green, EtBr (do liên k t
v i DNA gây đ t bi n). Trong khi đó, k t qu quan sát tr c quan s thay đ i màu
s c mà không c n m n p ho c b t k thi t b phát hi n chuyên d ng nào.
H n h p Calcein và Mn2+ đ c thêm vào tr c ph n ng. Do s có m t c a
ion Mn2+, Calcein liên k t v i Mn2+ nên ph n ng phát hu nh quang c a Calcein b
d p t t (không phát quang), dung d ch có màu cam. N ng đ ion Mg2+ trong môi

13
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
tr


ng (bên trái) cho màu vàng chanh d i ánh sáng th ng và phát
quang m nh d i đi u ki n UV.
Ph n ng âm (bên ph i) cho màu da cam d i ánh sáng th ng và không phát
quang d i đi u ki n UV.

14
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

CH

K53B-CNSH

NG 2: V T LI U VẨ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1. V T LI U
2.1.1. M u DNA
DNA đã đ

c tinh s ch c a các ch ng vi khu n:

Edwardsiella ictaluri E7, E5, E40 đ

c phân l p t i Vi t Nam, E. ictaluri

khu n 2 µm, b pipet, máy đo quang ph (Nh t)…

15
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

B ng 1: Danh sách các m i nhơn gen eip18 c a vi khu n E. ictaluri b ng
ph

ng pháp LAMP

Tên
m i

Lo i m i

Chi u dƠi m i
(nucleotide)

Trình t m i 5’-3’

F3

M i ngoài xuôi



B1c TTTT B2

CCAGAGGCCCCGGAGCAGTC
TTTTGCGTAAGTTCGCCTTCTGT

2.1.3. Các dung d ch hóa ch t c n chu n b
- Agarose 2%
- Dung d ch nhu m gel Ethidium bromide 0,5 µg/ml
- Dung d ch TAE 50x: 24,2 g Tris base; 5,71 ml acid acetic; 10 ml EDTA 0,5
M; ch nh pH = 8.
- Dung d ch Calcein:
B ng 2: ThƠnh ph n 10x Calcein LAMP buffer
ThƠnh ph n

N ng đ

Tris HCl pH 8.8

200mM

KCl

100 mM

(NH4)2SO4

100 mM

MnCl2

N ng đ

Tris HCl pH 8.8

200mM

KCl

100 mM

(NH4)2SO4

100 mM

MgSO4

0, 10, 20- 100 mM

Triton 100X
H nh pđ
2.2. PH

1%

c l c vô khu n, gi

-20ºC.

NG PHÁP NGHIÊN C U


Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

B ng 4: ThƠnh ph n ph n ng LAMP 25 µl
ThƠnh ph n

Th tích (µl)

1

10X LAMP buffer

2,5

2

dNTP 25 mM

0,5

3

Betaine 5M

1


9

H2 O

12,4

10

Bst DNA polymerase

1

11

DNA khuôn

1

i n di DNA
i n di s n ph m khu ch đ i c a ph n ng LAMP nh m so sánh v i k t qu
đ t đ c khi dùng ch th kim lo i phát hu nh quang Calcein, đ a ra kh ng đ nh v
đ nh y c a thu c th này.
C s lý thuy t: Ph ng pháp này d a trên m t đ c tính c a axit nucleic là

2.2.2.

pH trung tính mang đi n tích âm nh các nhóm phosphat n m trên khung
photphodieste c a các s i axit nucleic. i u đó có ngh a là các phân t s ch y v
c cd



Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

- Tr n đ u dung d ch loading buffer 6x v i m u theo t l 1:6. Tra m u vào
gi ng.
- Ch y đi n di b ng dòng đi n m t chi u v i đi n th 100 V, c

ng đ dòng

đi n 80 mA trong 50 phút.
- Nhu m b n gel trong dung d ch EtBr (n ng đ 0,5 l/ml) 10-15 phút.
- Quan sát v ch DNA trên máy soi gel.
Chú ý: Khi đi n di c n ph i m n p ng, do đó kh n ng ô nhi m cao.
h n ch vi c nhi m vào m u khác, luôn luôn spin xu ng tr
n p nh nhàng trong th i gian ng n nh t có th .

c khi m n p, và m

2.2.3. C t DNA b ng enzyme gi i h n
Enzyme gi i h n là các nuclease n i bào có kh n ng nh n bi t các đo n
DNA v i các trình t nucleotide nh t đ nh, bám vào đo n DNA đó và c t c hai s i
c a phân t DNA. Các enzyme gi i h n th ng đ c s d ng đ c t DNA:
T o đ u b ng: Sma I, HinC II, EcoR V c t hai s i DNA t i cùng m t đi m
t o hai đ u b ng.
T o đ u so le: Bgl II, Kpn I và Mnl I c t theo v trí l ch nhau trên hai s i t o
các đ u dính b sung có th b t c p tr l i.


(th ng 37ºC, 2 gi ). S n ph m ph n ng đ
agarose n ng đ thích h p.

19
Khóa lu n t t nghi p

0,2
nhi t đ và th i gian thích h p
c ki m tra b ng đi n di trên gel


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

2.2.4. Xác đ nh s có m t c a Mg2P2O7
Nguyên lý: S có m t c a Mg2P2O7 trong dung d ch ph n ng là k t qu c a
s k t h p gi a ion pyrophosphate t o ra t nguyên li u dNTP khi DNA đ c
khu ch đ i trong ph n ng LAMP và Mg2+ trong dung d ch ph n ng. Giá tr quang
h p th c a Mg2P2O7 b c sóng 400 nm là đ i l ng bi u th cho s có m t c a
Mg2P2O7, nói cách khác nó là giá tr bi u th s khu ch đ i DNA.
Ti n hành:
xác đ nh ph n ng có di n ra hay không, chúng tôi ti n hành
xác đ nh gián ti p s t o thành mu i Mg2P2O7 b ng ph ng pháp đo đ đ c: 25µl
c a ph n ng LAMP đ c pha loãng 5 l n chuy n 50µl h n h p sau ph n ng vào
cuvet. M u chu n là dung d ch h n h p tr c ph n ng. Sau đó đo OD400. L p l i
ba l n và l y k t qu trung bình.Giá tr OD400 thay đ i so v i đ i ch ng đ c xác
đ nh là có s t o thành k t t a làm t ng đ đ c c a dung d ch ph n ng đ ng ngh a

gen eip18. N ng đ m i ngoài có trong m i ph n ng là 0,16 µM.
iv im it l
m i, th c hi n song song m t ph n ng không có DNA khuôn làm đ i ch ng.
nh h ng c a n ng đ MgSO4 đ n ph n ng LAMP
S d ng n ng đ betaine, dNTP và t l m i ngoài:m i trong t i u đã xác
đ nh đ c. Ph n ng LAMP đ c th c hi n v i n ng đ Mg2+ cu i cùng trong t ng
ph n ng thay đ i: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 mM.
i v i m i n ng đ Mg2+,
th c hi n song song m t ph n ng không có DNA khuôn làm đ i ch ng. Ph n ng
2.2.8.

20
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

này có b sung Calcein trong thành ph n ph n ng đ nghiên c u nh h

ng c a

n ng đ Mg2+ t i s đ i màu c a Calcein.
nh h ng c a nhi t đ đ n ph n ng LAMP
S d ng n ng đ Mg2+, dNTP, t l m i trong:m i ngoài và n ng đ betaine
t i u đã xác đ nh đ c. Ph n ng LAMP đ c th c hi n m t s nhi t đ khác
nhau, bao g m: 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 và 80oC. Xác đ nh b ng đi n di
2.2.9.


K53B-CNSH

NG 3: K T QU VẨ TH O LU N

Chúng tôi ti n hành ph n ng LAMP v i 2 c p m i đ c thi t k đ c hi u
d a trên trình t c a gen eip18 c a vi khu n E. ictaluri. DNA khuôn là DNA
genome c a E. ictaluri E7 và m t s ch ng khác dùng làm đ i ch ng. Ph n ng
đ c ti n hành trong đi u ki n và thành ph n ph n ng đã đ
ph n ph ng pháp nghiên c u.
3.1. KHU CH

c trình bày trong

I GEN eip18

3.1.1. Khu ch đ i gen eip18 b ng ph
S d ng hai c p m i đ

ng pháp LAMP

c thi t k d a trên trình t gen eip18 có kích th

c

~ 500 bp chúng tôi s b khu ch đ i gen này. Ph n ng LAMP đ c th c hi n v i
DNA genome c a các ch ng nghiên c u, các thành ph n ph n ng và chu k nhi t
nh mô t
ph n v t li u và ph ng pháp. Phân tích s n ph m DNA c a ph n ng
b ng đi n di 3l s n ph m ph n ng LAMP trên gel agarose 2%.

5: E. tarda ATTC 15469

6: E. ictaluri ATCC 33202 (Ei)
B: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút
Hình 10B cho th y v i các m u d
t

ng tính thì xác đ nh đ

65oC

c giá tr OD400

ng ng v i s có m t c a Mg2P2O7 trong h n h p, đ ng ngh a v i vi c DNA
22
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
đ

c khu ch đ i. Ng

c l i, n u không xác đ nh đ

K53B-CNSH
c giá tr OD400 thì đ ng ngh a

v i DNA không đ c khu ch đ i. i u này đ c ch ng minh b ng ph

đ c s n ph m khu ch đ i b ng ph ng pháp LAMP v i c p m i đ c thi t k là
hoàn toàn chính xác.

Hình 11: C t s n ph m LAMP b ng enzyme Mnl I
M: marker 100bp; 1,3: s n ph m LAMP c t b ng Mnl I; 2: s n ph m LAMP không c t

23
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
3.2. NH H

NG C A CÁC Y U T

K53B-CNSH
LÊN PH N

NG LAMP VẨ S

I

MẨU C A THU C TH CALCEIN
3.2.1. nh h ng c a n ng đ dNTP
dNTP là nguyên li u chính cho quá trình sao chép DNA. Innis và c ng s .
(1988) đã công b r ng n ng đ dNTP có nh h ng đ n đ đ c hi u c a quá trình
khu ch đ i DNA s d ng DNA polymerase. N ng đ dNTP cu i cùng l n l t đi t
0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 mM đ c ki m tra đ tìm n ng đ t i u. Song
song v i m i n ng đ dNTP, th c hi n m t ph n ng không có DNA làm đ i


c khu ch đ i trong các ph n r t khác nhau. DNA đ c khu ch đ i nhi u nh t
ng ch y s 16, t ng đ ng v i n ng đ dNTP là 0,7 mM (Hình 12A).

24
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
T

K53B-CNSH

ng t k t qu đo đ đ c t i OD400 cho th y

các ph n ng d

ng, giá tr

OD400 b t đ u đ c xác đ nh 0,3 mM, t ng d n khi dNTP t ng lên 0,7 mM và k t
qu n đ nh h n b t đ u n ng đ 0,5 mM. N ng đ dNTP này th p h n r t nhi u
so v i các công b v vi c s d ng dNTP 1 mM đ khu ch đ i gen đ c tr ng c a vi
khu n nh ph ng pháp LAMP [13,26]. Do v y, n ng đ dNTP 0,5 mM đ c ch n
đ s d ng cho các nghiên c u ti p theo.
3.2.2.

nh h ng c a n ng đ Betaine
N m 2005, Yeh và c ng s đã công b khi t ng n ng đ Betaine thì l


B: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút 65oC
1-2: 0 M; 3-4: 0,1 M; 5-6: 0,2 M; 7-8: 0,3 M; 9-10: 0,4 M; 11-12: 0,5 M;
13-14: 0,6 M; 15-16: 0,7 M. Các đ
DNA. M: marker 100 bp
25
Khóa lu n t t nghi p

ng ch y l là đ i ch ng không có