BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN THỊ NGỌC ANH

Nghiªn cøu ®Þnh lîng steroid niÖu
b»ng gc/ms trong chÈn ®o¸n rèi lo¹n
sinh tæng hîp steroid bÈm sinh ë trÎ em

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN THỊ NGỌC ANH

Nghiªn cøu ®Þnh lîng steroid niÖu
b»ng gc/ms trong chÈn ®o¸n rèi lo¹n
sinh tæng hîp steroid bÈm sinh ë trÎ em
Chuyên ngành : Hóa sinh Y học
Mã số : 62720112

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, chia sẻ trong cuộc
sống và trong công việc, giúp tôi hoàn thành khóa học.
Xin cảm ơn tất cả người bệnh, các bé khỏe mạnh đã cung cấp mẫu bệnh
phẩm để thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Xin trân trọng cảm ơn!

Ngày 17 tháng 7 năm 2019

NCS. Trần Thị Ngọc Anh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Trần Thị Ngọc Anh, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y
Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh y học, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của

Tiến sĩ Trần Thị Chi Mai và Phó giáo sư- Tiến sĩ Trần Minh Điển, Phó
Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được

công bố tại Việt Nam. Nghiên cứu định lượng steroid niệu bằng kỹ
thuật sắc ký khí – khối phổ có giá trị trong chẩn đoán bệnh lý rối loạn
sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh ở trẻ em, được thực hiện lần
đầu tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung

thực và khách quan, đã được xác nhận, chấp thuận của cơ sở nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 17 tháng 7 năm 2019

FSH
GC/MS

Tiếng Anh
Tiếng Việt
3β-Hydroxysteroid dehydrogenase
5α-Dihydrotestosterone
5α-Tetrahydrocortisol
11-Hydroxy androsterone
11-Hydroxy etiocholanolone
11β-Hydroxylase
11-Ketoandrosterone
17β- Hydroxysteroid dehydrogenase
17α-Hydroxyprogesterone
17-Hydroxypregnanolone
21-Hydroxylase
Androstenetriol
Adrenocorticotropic hormone
Hormon kích thượng thận
Acid deoxyribonucleic
Apparent mineralocorticoid excess
Androsterone
Clinical & Laboratory
Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét
Standards Institute
Corticosterone methyl oxidase

nghiệm
Chưa xác định
Hệ số biến thiên

tế
Không xác định
Sắc ký lỏng- khối phổ kép

KXĐ
LC/MS-MS

Liquid chromatographyTandem mass spectrometry

Hormon giải phóng

Hiệp hội Hóa sinh lâm sàng và


LH
PD
POR
PT
PTL
QC
RLPTGT
SD
SIM
SHBG
StAR
THA
THB
THE
THF
THS

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC BIỂU ĐỒ


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo hệ thống sắc ký khí khối phổ................................................4


11

ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh là bệnh lý tuyến vỏ
thượng thận, giảm tổng hợp một hoặc nhiều hormon vỏ thượng thận do thiếu
một phần hoặc hoàn toàn hoạt tính của enzym xúc tác phản ứng tổng hợp
hormon steroid. Trong nhóm này, một số bệnh thường gặp là thiếu enzym 21–
hydroxylase

(21-OH),

thiếu

11β-hydroxylase

(11β-OH),

đoán cho từng bệnh [11],[12].
Tại Việt Nam, từ 1999 đến 2016 có 842 bệnh nhân được chẩn đoán và
điều trị TSTTBS tại Bệnh viện Nhi Trung ương [13]. Hiện tại, Bệnh viện Nhi
trung ương đang sử dụng các xét nghiệm định lượng một số hormon bằng các
kỹ thuật miễn dịch. Kỹ thuật miễn dịch đã giúp ích trong nhiều trường hợp,
tuy nhiên nhiều trường hợp phức tạp bị bỏ sót. Hơn 200 trường hợp được
phân tích gen CYP21A2, CYP11B1 giúp chẩn đoán xác định thiếu 21-OH
hoặc thiếu 11β-OH [14],[15]. Một số trường hợp thiếu 3β-HSD II, 5αreductase type 2 được chẩn đoán nhờ gửi mẫu phân tích ở nước ngoài nên cần
nhiều thời gian và kinh phí [16],[17]. Bệnh viện Nhi Trung ương là trung tâm
chăm sóc sức khỏe trẻ em hàng đầu ở Việt Nam. Việc áp dụng kỹ thuật phân
tích steroid niệu bằng GC-MS phù hợp với điều kiện Việt Nam, giúp nâng cao
chất lượng chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh cho trẻ em là nhu cầu cần thiết.
Thẩm định phương pháp cần tiến hành trước khi đưa kỹ thuật xét nghiệm mới
vào sử dụng nhằm đánh giá hiệu năng của phương pháp. Trên cơ sở kỹ thuật
đã được chuẩn hóa, thẩm định cần thiết lập khoảng tham chiếu giúp diễn giải
kết quả xét nghiệm. Đây cũng là một đòi hỏi bắt buộc cho các phòng xét
nghiệm được công nhận ISO 15189. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu định lượng
steroid niệu bằng GC/MS trong chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp steroid
bẩm sinh ở trẻ em” tiến hành với hai mục tiêu:
Mục tiêu 1: Thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS và thiết
lập khoảng tham chiếu steroid niệu ở trẻ em ≤ 11 tuổi.
Mục tiêu 2: Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS trong chẩn
đoán một số bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh.


13

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ

phá thành các mảnh ion. Các ion chọn lọc đặc trưng cho mỗi chất được
chuyển đến bộ phận lọc. Dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép
các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm


14

biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau
đó được chuyển đến máy tính để tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung
cấp và đưa ra kết quả khối phổ.
GC/MS được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các hoạt chất bởi độ
nhạy và độ đặc hiệu cao, mỗi chất được đặc trưng bởi thời gian lưu và các
mảnh ion đặc hiệu cho cấu trúc phân tử của hoạt chất đó. GC/MS được ứng
dụng trong phát hiện thuốc, các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu, các
chất có trong mẫu thử chưa biết. GC/MS là một phương pháp có độ nhạy cao
được sử dụng để định tính và định lượng các chất ở thể khí (hay được hóa
hơi). Ngưỡng phát hiện của phương pháp là picrogram [18].
1.1.2.1. Cấu tạo của hệ thống GC/MS
3. Kim bơm
1. Nguồn cấp khí
6. Bộ phận
kết nối

Bộ phận
khối phổ

11. Bảng điều
khiển điện tử

9. Đầu


2. Bộ điều khiển khí nén
4. Lò cột
6. Kết nối sắc ký với khối phổ
8. Bộ phận phân tích khối lượng
10. Hệ thống chân không


15



Cửa tiêm mẫu: gồm một bơm tiêm mẫu tự động (3), dung môi chứa hỗn
hợp các chất sẽ được tiêm tự động vào hệ thống tại cửa này. Mẫu sau đó được
hệ thống cấp khí, điều khiển khí nén (1 và 2) dẫn qua hệ thống sắc ký khí,
thường sử dụng các loại khí trơ như heli, hydro. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu
được nâng lên cao để mẫu từ dạng lỏng trở thành dạng khí.



Vỏ ngoài: vỏ ngoài của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt (4).
Nhiệt độ của lò này dao động từ 40oC cho đến 320oC.



Cột: bên trong hệ thống GC chính là một cuộn ống nhỏ hình trụ với mặt
trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt (5). Các chất trong hỗn hợp
được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này. Sau đó, khi phân tách hỗn
hợp thành các thành phần khác nhau dựa theo ái lực khác nhau với pha tĩnh,
các chất chuyển qua bộ phận kết nối sang bộ phận khối phổ.

Quy trình kỹ thuật
Thủy phân steroid niệu liên hợp với acid glucuronic và acid sulphuric
bằng enzym glucuronidase và arylsulphatase ở nhiệt độ 37 0C qua đêm hoặc ở
550C trong 3 giờ. Hoạt hóa cột Bond Elut bằng methanol và rửa lại bằng nước
cất. Cho mẫu lên cột, các steroid tự do được tách chiết, tinh sạch bằng cột
Bond Elut C18, chỉ steroid được giữ lại tại màng lọc của cột. Steroid tự do
được rửa giải bằng methanol và làm khô bằng cách cho bay hơi để loại bỏ
methanol khỏi steroid. Tạo dẫn xuất giữa steroid với methoxyamine và TMSI
để bảo vệ các nhóm chức –OH không bị phân hủy bởi nhiệt độ cao trong khi
làm hóa hơi steroid và thực hiện sắc ký khí. Steroid sau khi tạo dẫn xuất và
tách chiết được bơm trực tiếp vào máy sắc ký khí khối phổ và được vận
chuyển trong cột sắc ký nhờ khí trơ như heli. Sau khi phân tách các thành
phần steroid khác nhau nhờ tương tác với pha rắn, các steroid được vận
chuyển đến bộ phận khối phổ. Tại đây dưới tác dụng của dòng điện các
steroid niệu được ion hóa, được bắn phá tạo thành các mảnh ion đặc trưng cho
cấu trúc phân tử của các steroid. Trong phương pháp SIM (selected ion
monitoring), chỉ ion chọn lọc mới đến bộ cảm biến để phát hiện. Mỗi steroid
niệu đặc trưng bằng một đỉnh (peak) trên sắc ký đồ, thời gian xuất hiện đỉnh
từ khi mẫu đi qua cột được gọi là thời gian lưu. Mảnh ion được bắn phá từ
phân tử mẹ đặc trưng giúp nhận diện steroid trên sắc ký đồ [18].
Chuẩn nội (internal standard) được cho vào các mẫu với một lượng như
nhau để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình phân tích. Mẫu chuẩn được phân
tích cùng với mẫu bệnh để xây dựng đường chuẩn giúp tính nồng độ steroid
trong mẫu thử. Xác định thời gian lưu, ion đặc hiệu tương ứng của các steroid
trong mẫu thử dựa vào phân tích các steroid tinh khiết trong mỗi mẻ phân tích.


17

Ưu điểm kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS: sắc ký giúp phân


An

Androsterone

Et
DHEA
11β-OH-An
11β-OH-Et
11-OXO-Et

Etiocholanolone
Dehydroepiandrosterone
11β-Hydroxy-androsterone
11β-Hydroxy-etiocholanolone
11-Oxo-etiocholanolone

16α-DHEA

16α-OH-DHEA

PD

Pregnanediol

5PD
Pregnadienol
17OHPN
3α5α17HP
PT

dehydrocorticosterone
5α-Tetra-11dehydrocorticosterone
Tetrahydrocorticosterone
5α-Tetrahydrocorticosterone
Tetrahydroaldosterone
Tetrahydrocortisone
Tetrahydrocortisol
5α-Tetrahydrocortisol
α-Cortolone
β-Cortolone
α-Cortol
β-Cortol
6β-OH-cortisol

Sản phẩm chuyển hóa của
Androstenedione, testosterone,
5α-dihydrotestosterone, DHEA
Testosterone, DHEA
Dehydroepiandrosterone
11β-OH-androstenedione, cortisol
Cortisol
Cortisol
Dehydroepiandrosterone,
Dehydroepiandrosterone-sulfate
Progesterone, 11deoxycorticosterone
Pregnenolone
Pregnenolone (pregnenediol)
17-OH-progesterone
17-OH-progesterone
17-OH-progesterone

về kết quả thẩm định phương pháp. Hiện nay, nhiều thuật ngữ khác nhau
được sử dụng như đánh giá phương pháp, định trị phương pháp, xác nhận giá
trị sử dụng của phương pháp, phê duyệt phương pháp. Các thuật ngữ này đều
là cách gọi khác nhau của thẩm định phương pháp/ xác nhận phương pháp.
Thẩm định phương pháp nhằm đánh giá sai số kỹ thuật của phương pháp
phân tích - một bước quan trọng trước khi đưa phương pháp mới vào sử dụng
hoặc sau khi hiệu chỉnh phương pháp. Các phương pháp đo lường luôn bị ảnh
hưởng bởi sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống. Sai số hệ thống luôn xảy ra
theo một hướng và làm cho tất cả các kết quả xét nghiệm cao hơn hoặc thấp
hơn giá trị thực. Để khẳng định các tiêu chuẩn kỹ thuật của phương pháp đáp
ứng với tiêu chuẩn chất lượng, các sai số gặp phải là chấp nhận được, cần
thẩm định phương pháp với các thực nghiệm thích hợp.
Đối với các phương pháp phân tích hóa sinh, các thông số cần thẩm định
bao gồm: độ đặc hiệu phân tích (Analitical Specifility), độ nhạy phân tích
(Analytical sensitivity), khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity range
and Calibration curve), độ lệch/độ đúng (Bias/truenesss) hay độ chính xác/
xác thực (Accuracy), độ lặp hay độ tập trung (Precision). Sau khi các thông số
thẩm định được đảm bảo cần thiết lập khoảng tham chiếu (Reference
intervals). Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp


20

dụng trong phòng xét nghiệm, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn
lực của phòng xét nghiệm...
Độ nhạy phân tích (Analytical Sensitivity)
Hướng dẫn của CLSI khuyến cáo sử dụng 3 thông số sau:
Giới hạn trắng (limit of blank: LOB) là kết quả đo lường cao nhất có thể
quan sát được của mẫu trắng; thường ước tính bằng giá trị trung bình +
1,65SD của mẫu trắng.

sai số hệ thống dựa trên sự khác biệt giữa hai phương pháp. Nhiều thuật toán
thống kê có thể sử dụng để phân tích kết quả của thử nghiệm so sánh phương
pháp: đồ thị khác biệt (difference plot), đồ thị so sánh (comparison plot), phân
tích hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan. Phương trình tương quan thiết
lập được từ phân tích hồi quy tuyến tính là y = ax + b. Trong đó y là kết quả
của phương pháp xét nghiệm cần thẩm định, x là kết quả phương pháp tham
chiếu, a là độ dốc, b là giao điểm của đồ thị với trục tung. Độ dốc cho biết sai
số tỷ lệ (proportional error) giữa phương pháp cần xác nhận với phương pháp
tham chiếu, lý tưởng a có giá trị bằng 1 (thường là 95% CI của độ dốc a bao
hàm giá trị 1). Giao điểm cho biết sai số hằng định (constant error) giữa
phương pháp cần xác nhận với phương pháp tham chiếu, lý tưởng b có giá trị
bằng 0 (thường là 95% CI của giá trị b bao hàm giá trị 0).
Sự khác biệt giữa phương pháp cần thẩm định với phương pháp tham
chiếu cần được phân tích, đánh giá. Nếu sự khác biệt nhỏ, có thể xem như hai
phương pháp có độ xác thực tương đương nhau, hai phương pháp tương đồng
và phương pháp mới có thể thay tế cho phương pháp tham chiếu. Nếu sự khác
biệt lớn và không thể chấp nhận được về y khoa, cần phải đánh giá xem
phương pháp nào xác thực hơn. Thực nghiệm đánh giá độ thu hồi (recovery


22

experiment) và thực nghiệm đánh giá yếu tố nhiễu (interference experiment)
có thể sử dụng để cung cấp thêm các thông tin [23].
Trên thực tế, phòng xét nghiệm khó có thể có phương pháp tham chiếu
để so sánh với phương pháp cần thẩm định. Trong trường hợp này, thực
nghiệm đánh giá độ xác thực có thể được tiến hành bằng việc tham gia vào
chương trình ngoại kiểm. So sánh kết quả thu được của phương pháp làm tại
phòng xét nghiệm và kết quả ngoại kiểm gửi về. Chương trình ngoại kiểm
steroid niệu rất hữu ích và cần thiết trong so sánh, đánh giá kết quả giữa các

nghiệm có thể thiết lập hoặc xác nhận khoảng tham chiếu [25]. Với mỗi kỹ
thuật xét nghiệm mới được triển khai tại phòng xét nghiệm, rất cần thiết lập
khoảng tham chiếu (reference interval) vì các thông số đó có sự khác biệt giữa
các đối tượng: sự khác biệt theo giới tính, theo tuổi, theo chủng tộc và vùng
địa lý. Vì vậy các chuyên gia y tế khuyến cáo, mỗi phòng xét nghiệm nên tự
thiết lập giá trị tham chiếu cho riêng mình với mỗi xét nghiệm theo các bước:
Bước 1: lựa chọn quần thể tham chiếu là quần thể những người khỏe
mạnh ít có nguy cơ mắc các bệnh được nghiên cứu mà từ đó lựa chọn ra đối
tượng tham chiếu để thiết lập khoảng tham chiếu. Quần thể tham chiếu cần
đại diện cho quần thể lớn. Căn cứ vào các thông tin và các nghiên cứu có
trước để lựa chọn quần thể nghiên cứu thích hợp.
Bước 2: lựa chọn đối tượng tham chiếu trong quần thể nghiên cứu mà
cách đơn giản nhất là dựa vào bộ câu hỏi phỏng vấn. Các câu hỏi phỏng vấn
nhằm xác định thông tin cá nhân, các thói quen và yếu tố có thể ảnh hưởng
đến xét nghiệm cần xây dựng khoảng tham chiếu để loại bỏ những cá nhân
có nguy cơ cao mắc bệnh được nghiên cứu. Một số yếu tố cần được phỏng
vấn là hút thuốc, uống rượu, mang thai, tiền sử gia đình, các thuốc hiện đang
dùng… Thông thường có hai cách lấy mẫu để thiết lập khoảng tham chiếu là
lấy mẫu trực tiếp và lấy mẫu gián tiếp. Mẫu trực tiếp được lấy từ đối tượng
tham chiếu đã được lựa chọn qua sàng lọc bằng bộ câu hỏi phỏng vấn với
người khỏe mạnh trong cộng đồng. Cách lấy mẫu gián tiếp từ những mẫu đã
thu thập để cho mục đích khác trong phòng xét nghiệm như mẫu của người


24

cho máu khỏe mạnh, của người đến khám sức khỏe định kỳ, của người thực
hiện xét nghiệm sàng lọc của người bệnh đến thực hiện tiểu phẫu hoặc người
đến làm sàng lọc gen.
Bước 3: chuẩn bị phân tích mẫu và phân tích mẫu với các trang thiết bị

không dễ thực hiện ở tất cả các phòng xét nghiệm cho tất cả các xét nghiệm.
Tuy nhiên, thiết lập khoảng tham chiếu là bắt buộc với các kỹ thuật lần đầu
được triển khai và chưa có khoảng tham chiếu của nhà sản xuất hay khoảng
tham chiếu của phòng xét nghiệm khác lân cận. Vì vậy, có thể sử dụng cách thứ
hai là xác nhận khoảng tham chiếu của phòng xét nghiệm khác hoặc nhà sản
xuất cho các phòng xét nghiệm nhỏ, ít có điều kiện thiết lập mới khoảng tham
chiếu.
Khoảng tham chiếu nồng độ và tỷ lệ các steroid niệu được nhiều tác giả
công bố trên các tạp chí thế giới. Caulfield M và cộng sự thiết lập khoảng tham
chiếu cho 59 trẻ sơ sinh theo đơn vị µg/g creatinine và sử dụng mẫu nước tiểu
ngẫu nhiên trong đó có một số steroid đặc trưng cho trẻ sơ sinh như 6α-OHTHA, 16α-OH-DHEA, 6α-OH-THS… [7]. Homma K và cộng sự xây dựng
khoảng tham chiếu cho 62 trẻ sơ sinh sử dụng đơn vị mg/g creatinine, trong đó
có nồng độ PTL và tỷ lệ PTL/(β-THE + α-THE) để chẩn đoán thiếu 21-OH cho
trẻ sơ sinh [12]. Nasser A. Dhayat và cộng sự nghiên cứu thiết lập khoảng tham
chiếu steroid niệu theo đơn vị µg/mmol creatinine cho 43 trẻ từ mới sinh đến 1
tuổi ở nhiều tuần khác nhau nhằm thiết lập đường cong sự biến đổi các steroid
niệu theo thời gian phát triển của trẻ [26]. Lucas-Herald AK thiết lập khoảng
tham chiếu cho các tỷ lệ chẩn đoán ở 252 đối tượng từ sơ sinh đến trưởng thành
[27]. Bên cạnh đó, nhiều bài báo khi công bố ứng dụng định lượng steroid niệu
bằng GC/MS trong chẩn đoán cá bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid
đã công bố giá trị tham chiếu làm căn cứ chẩn đoán.
1.3. Sinh tổng hợp hormon steroid và bệnh rối loạn tổng hợp steroid bẩm sinh
1.3.1. Tổng hợp hormon steroid

Cholesterol được vận chuyển vào trong ty thể nhờ protein StAR
(steroid acute response protein). Trong ty thể, cholesterol cắt đi một chuỗi 5C