BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN LÂM HỒNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ,
THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỂ ĐỊNH TÍNH,
ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ
CỦA CHI CLEISANTHUS, HỌ THẦU DẦU
(EUPHORBIACEAE)

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG
VIỆN HÓA SINH BIỂN - VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC &
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Trần Việt Hùng
PGS. TS. Đoàn Thị Mai Hương

Phản biện 1: ........................................................................
Phản biện 2: ........................................................................
Phản biện 3: ........................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường

Từ các kết quả đó, Đề tài độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN.14/16 của
Bộ Khoa học và Công nghệ đã tiến hành thử hoạt tính kháng ung thư của cao
khô chiết xuất từ quả cây Chà chôi trên chuột Nude cấy tế bào ung thư phổi
người với liều 100mg/kg cân nặng, cho thấy 100% chuột còn sống và kéo dài
được thời gian sống sau 6 tuần điều trị so với nhóm chứng không được dùng
cao. Vì vậy, cao khô đang được tiếp tục nghiên cứu, phát triển thành nguyên liệu
thuốc. Để xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô này, rất cần có chất chuẩn
cleistantoxin và cleisindoside D. Tuy nhiên, 2 chất này đang được nghiên
cứu, phát triển thuốc mới nên trên thế giới chưa có chất chuẩn đối chiếu. Vì
vậy, cleistantoxin và cleisindoside D phải được thiết lập thành chất chuẩn
gốc. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới, hầu như ở Việt Nam còn chưa có công
trình nào công bố về thiết lập chuẩn gốc, chủ yếu là thiết lập chuẩn thứ cấp.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, luận án “Nghiên cứu phân lập, tinh chế,
thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của
chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” là công trình đầu tiên
thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D từ
quả cây Chà chôi (có hàm lượng 2 chất này cao nhất) với các mục tiêu sau:
- Mục tiêu 1: Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của cleistantoxin và
cleisindoside D từ quả cây Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn và xác
định cấu trúc các chất tinh khiết mới phân lập được.

1


- Mục tiêu 2: Thiết lập được hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và
cleisindoside D
- Mục tiêu 3: Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định
lượng một số lignan trong quả cây chi Cách hoa (Cleistanthus).
2. Những đóng góp mới của luận án
- Về mặt hoá học

(1 trang); Luận án có 96 tài liệu tham khảo và 240 trang phụ lục.

2


NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Đã tổng quan được các nội dung chính liên quan đến luận án gồm có:
- Tổng quan về chi Cách hoa (Cleistanthus), tình hình nghiên cứu thành
phần hoá học và hoạt tính kháng ung thư của chi Cleistanthus trên thế giới
và tại Việt Nam.
- Tổng quan về nhóm chất lignan: khái niệm, phân loại, một số
aryltetralin lignan đang được phát triển thành thuốc điều trị ung thư, một số
hoạt chất chính nhóm aryltetralin lignan được phân lập được từ quả cây thuộc
chi Cleistanthus và một số phương pháp phân tích hoạt chất nhóm aryltetralin
lignan trong thực vật.
- Tổng quan về chất chuẩn: khái niệm và phân loại chất chuẩn gồm: chất
chuẩn gốc (PCRS) và chất chuẩn thứ cấp (SCRS), tổng quan một số hướng
dẫn về thiết lập chất chuẩn. Theo ISO 17034 và ISO GUIDE 35 quy trình
thiết lập chất chuẩn gồm các bước: xác định nhu cầu thiết lập chất chuẩn, thu
thập nguồn nguyên liệu, chuẩn bị nguyên liệu thiết lập chuẩn, đóng ống
chuẩn, đánh giá độ đồng nhất, xác định các đặc tính, xác định giá trị ấn định
trên COA, dán nhãn, bảo quản và nghiên cứu độ ổn định.
- Tổng quan về xác định các đặc tính của chất chuẩn gốc: Theo hướng dẫn
của IP, USP, WHO các chỉ tiêu xác định đặc tính (characterization) của chất
chuẩn gốc gồm bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóng
chảy, góc quay cực riêng, bộ phổ IR, NMR, MS, UV…và xác định độ tinh khiết
chất chuẩn gốc bằng phương pháp cân bằng khối lượng: xác định tạp chất liên
quan và tạp chất phân huỷ bằng các kỹ thuật: HPLC/DAD, xác định tạp chất vô
cơ bằng phương pháp cắn sau nung (residue on ignition-ROI) hay tro sulfat, xác

- Hoá chất, dung môi để chiết xuất, phân lập, tinh chế đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích. Hoá chất, dung môi chạy HPLC và đo phổ NMR (Merck)
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và phân tích của Viện Hoá
học và Viện Hoá sinh biển-Viện HL KH & CN VN, Bộ môn Hoá Phân tích Độc chất, ĐH Dược HN, Viện KNT TƯ, Viện KNT TPHCM.
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:
- Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc chất cleistantoxin, cleisindoside
D từ quả Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.
- Xây dựng bộ dữ liệu phổ nhận dạng các các chất cleistantoxin, cleisindoside D
nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ UV, IR, MS, NMR.
- Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô cơ và tạp chất bay
hơi của các chất cleistantoxin, cleisindoside D.
- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D.
- Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng một số
lignan trong quả của chi Cách hoa
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng bước đầu định tính, định lượng một
số lignan trong quả của chi Cách hoa.
2.3.1. Phương pháp phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của chất tinh khiết
- Phân lập các chất bằng sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel, sephadex LH-20, SK
lớp mỏng bán điều chế silica gel 60 GF254 và silica gel 60 RP-18 GF254 (Merck).

4


- Tinh chế các chất tinh khiết bằng: kết tinh và cột cổ điển nhồi hạt Silica
gel pha đảo YMC-GEL ODS-A có cỡ hạt 75 μm (YMC).
- Xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng

lượng đề nghị
pháp thử
Tính chất
Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan
DĐVN V
Nhiệt độ nóng Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảy
DSC
chảy
trong TL công bố
Góc quay cực Giá trị GQC phải phù hợp với GQC trong TL phụ lục 6.4
riêng
công bố
DĐVN V
Bộ dữ liệu phổ chuẩn
Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng
Phổ HR-MS
HR-MS
và phù hợp với TL đã công bố
Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ của chất
Phổ NMR
NMR
tinh khiết trong TL đã công bố
Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học
Phổ IR
IR
của chất tinh khiết trong TL đã công bố
Dữ liệu phổ UV-VIS phải có các max trùng với
Phổ UV-VIS
UV-VIS
phổ của chất tinh khiết trong TL đã công bố

tại 3 PTN đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO 17025. Mỗi PTN nhận 6 ống
chất chuẩn lấy ngẫu nhiên cùng tiêu chuẩn cơ sở để tiến hành phân
tích. Tập hợp các kết quả của ba PTN tham gia (n = 18), đánh giá kết
quả bằng test ANOVA một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn và Flt. Khi
Ftn > Flt kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khác nhau có ý
nghĩa, giá trị độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất bay hơi được
lấy từ kết quả trung bình của 3 PTN.
• Xác định giá trị ấn định công bố trên phiếu kiểm nghiệm COA bằng
phương pháp cân bằng khối lượng (mass-balance):
Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100
• Xác định độ không đảm bảo đo:
Độ không đảm bảo đo của hàm lượng tạp chất liên quan bằng
HPLC/DAD và tạp chất bay hơi bằng TGA. Mỗi chất chuẩn được
gửi đến 3 PKN, mỗi phòng 6 ống, tiến hành phân tích 6 mẫu cho từng
chỉ tiêu độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất bay hơi.
txS
Độ không đảm đo chuẩn của mỗi PKN : us =
√N
Trong đó:
N
:
Số lần lặp lại thí nghiệm
t
:
Giá trị tra bảng test Student
S
:
Độ lệch chuẩn
Độ không đảm bảo đo kết hợp của 3 PKN (U combined-Uc)
Uc = √u2s1 + u2s2 + u2s3


5.
6

Mức chất
Phương
Yêu cầu
lượng đề nghị
pháp thử
Tính chất
Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan
DĐVN V
Nhiệt độ nóng Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảy
DSC
chảy
trong TL công bố
Góc quay cực Giá trị GQC phải phù hợp với GQC trong TL phụ lục 6.4
riêng
công bố
DĐVN V
Bộ dữ liệu phổ chuẩn
Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng
Phổ HR-MS
HR-MS
và phù hợp với TL đã công bố
Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ của chất
Phổ NMR
NMR
tinh khiết trong TL đã công bố
Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học

- Tính hàm lượng hoạt chất
ST x Cc x DT x 100%
HL% =
SC x M x (100 − X) x 100 x 1000

7


Thẩm định phương pháp phân tích bằng HPLC/DAD.
Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH: độ đặc hiệu, khoảng
tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng và giới hạn định lượng (LOQ).
Áp dụng Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời
một số lignan trong quả cây chi Cách hoa bằng HPLC/DAD
Quả cây Chà chôi và cây Cách hoa eberhardt.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA
CLEISTANTOXIN VÀ CLEISINDOSIDE D
Qua khảo sát hàm lượng một số hoạt chất trong cao khô có hoạt tính
kháng ung thư trên chuột Nude và trong quả của chi Cách hoa (Cleistanthus),
tìm thấy 2 hoạt chất chính là cleistantoxin, cleisindoside D (glycosid của
cleistantoxin) có hoạt tính sinh học, hàm lượng cao nhất và là những chất đặc
trưng của chi này. Vì vậy, lựa chọn hai chất tinh khiết này để thiết lập chất chuẩn
định lượng. Bên cạnh đó, tìm thấy trong quả Chà chôi có hàm lượng
cleistantoxin, cleisindoside D cao nhất, nên sử dụng nguồn thực vật này để phân
lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.
3.1.1. Phân lập thô cleistantoxin và cleisindoside D trên cột silica gel
Để phân lập được 2 chất cleistantoxin và cleisindoside D làm
nguyên liệu thiết lập chất chuẩn sử dụng cột thuỷ tinh trung tính (80x10 cm)
nhồi silica gel 60 (40-63 m). Dùng hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2 sau đó
thêm MeOH với tỉ lệ tăng dần từ 2, 5, 10...100%. Kiểm tra các bình giống

Chất tinh chế được tiến hành đo phổ HR-MS, CD, 1D và 2D-NMR trùng khớp
với dữ liệu phổ của chất cleistantoxin phân lập từ loài C. indochinensis, cho phép xác
định chất tinh chế được chính là hợp chất (7R,8R,7′R,8′R)-7-hydroxy-6-methoxy3′,4′:4,5-bis(methylenedioxy)-2,7′-cyclolignan-9′,9-olide có tên là cleistantoxin.
3.1.3. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleisindoside D
52,9519 g cắn D thu được có chứa cleisindoside D được tiếp tục
phân lập, tinh chế theo sơ đồ sau:

9


Hình 3.2.Sơ đồ phân lập, tinh chế cleisindoside D thành NLTLCC
Đo phổ HRESI-MS, CD, 1D và 2D-NMR chất tinh chế được trùng khớp
với dữ liệu phổ của chất là 6-methoxy-7-(β-D-glucopyranosyloxy)-3',4':4,5bis(methylenedioxy)-2,7'-cyclolignan-9',9-olide chính là cleisindoside D.
Trong quá trình phân lập cleistantoxin và cleisindoside D làm chất chuẩn gốc
định lượng, đã phân lập thêm được 0,5235 g CT1 (chất mới), 0,5481 g
cleisindoside A, lượng chỉ đủ làm chất chuẩn định tính. Vì vậy, cần khẳng định
cấu trúc của cleisindoside A và xác định cấu trúc chất CT1 làm chuẩn định tính.
3.1.4. Khẳng định cấu trúc của cleisindoside A làm chất chuẩn định tính
Khi tinh chế cleisindoside D trên cột C18, tách riêng được vài lọ kết tinh dưới
dạng chất rắn màu trắng, tiến hành đo phổ HR-MS, 1D, 2D-NMR và so với tài
liệu tham khảo, chất phân lập được xác định là hợp chất cleisindoside A, do
lượng chất phân lập được ít nên sử dụng làm chất chuẩn định tính.
3.1.5. Phân lập và xác định cấu trúc các chất mới từ quả Chà chôi
Trong quá trình phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D, luận án đã
phân lập, tinh chế được 8 chất. Tiến hành đo phổ NMR, HR-MS, IR, UV-VIS,
CD, nhiệt nóng chảy (Mp), góc quay cực riêng ([α]D20)… đã xác định cấu trúc 8
chất lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên và đặt tên là: 7’,8’-dehydrocleistantoxin
(CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4),
cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7),
cleistonkinin C (CT8). Đây là đóng góp lớn của luận án trong nghiên cứu các


CT6
(Cleistonkinen)

CT7
(Cleistonkinin E)

CT8
(Cleistonkinin C)

Cleistantoxin
(Chuẩn định lượng)

Hình 4.1. Công thức cấu tạo của các chất chuẩn và chất mới phân lập được quả Chà chôi
3.2. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC
3.2.1. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D
Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistantoxin và cleisindoside D
Kết quả khẳng định cấu trúc các chất cleistantoxin và cleisindoside D bằng
1D và 2D-NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, CD…cho thấy bộ phổ của 2 chất phân
lập được trùng với bộ dữ liệu đã công bố của 2 chất cleistantoxin và cleisindoside
D. Từ đó, xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc định lượng
cleistantoxin và cleisindoside D gồm: tính chất, nhiệt độ nóng chảy, góc quay
cực riêng, bộ phổ 1H, 13C-NMR, HR-MS, IR và UV-VIS dựa trên các tài liệu đã
công bố và các kết quả thực nghiệm của luận án (phụ lục 1.3 và 1.4).
Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí
của cleistantoxin và cleisindoside D bằng HPLC/DAD.
- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan
của cleistantoxin và cleisindoside D
Cột: Inertsil® ODS-3 (250 x 4,6 mm; 5 m)


% ACN
%H2O
Thời gian (phút)
0
27
40
50
45
73
50
27
Thời gian phân tích 55 phút
Tốc độ dòng 1,0 ml/phút
Thể tích tiêm: 20 µL
Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

73
50
27
73

- Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên
quan của cleistantoxin và cleisindosid D theo hướng dẫn của ICH.
Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng
cleistantoxin và cleisindoside D
Bảng 3.21. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin
Chỉ tiêu và tiêu
chuẩn áp dụng
1.
2.

tử ngoại khả
VIS
203 và 286 nm  2 nm
kiến.
Phổ IR trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400
Phổ hồng cm-1 có các đỉnh đặc trưng trong khoảng: là
Phổ hồng
ngoại (IR) 3565, 3466, 2931, 1773, 1617, 1483, 1297,
ngoại
1230, 1142, 1047  20 cm-1
Phổ cộng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR có các
Phổ 1Hhưởng từ độ chuyển dịch hoá học đặc trưng: 6,72; 6,66;
NMR
hạt nhân 6,64; 6,22; 5,91; 5,88; 5,87; 5,86; 4,99; 4,59; (CDCl3, 500
1
H-NMR 4,47; 4,12; 4,02; 2,84; 2,71  0,5 ppm
MHz)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR có các
Phổ cộng độ chuyển dịch đặc trưng: 38,7; 43,9; 44,6;
Phổ 13Chưởng từ 59,8; 70,4; 71,8; 101,2; 100,9; 104,1; 107,6;
NMR
hạt nhân 111,1; 124,1; 124,7; 132,9; 133,0; 134,9; (CDCl3, 125
13
C-NMR
MHz)
141,5; 146,5; 147,2; 149,4; 174,2  0,5 ppm
Tính chất

12


99,5%
diện tích)
kí
Độ tinh
Độ tinh khiết DSC của nguyên liệu thiết lập Quét nhiệt vi
khiết DSC chuẩn không được nhỏ hơn 99,0%
sai
Không lớn hơn 1,0%

Bảng 3.22. Tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D
Chỉ tiêu và tiêu
chuẩn áp dụng
1.
2.
3.

Tính chất
Nhiệt độ
nóng chảy
Góc quay
cực riêng
Phổ UV-VIS

Phổ hồng
ngoại IR
(KBr)
Phổ cộng
4. hưởng từ hạt
Định
nhân 1Htính

ngoại khả kiến.
hấp thụ ở bước sóng 203 và 286 nm  2 nm.
Phổ IR có các đỉnh đặc trưng trong khoảng:
1035; 1073; 1235; 1475; 1619; 1772; 2932; Phổ hồng ngoại
3419 cm-1 + 20 cm-1
Phổ 1H-NMR có các độ chuyển dịch đặc trưng:
2,70; 3,04; 3,18; 3,28; 3,39; 3,41; 3,67; 3,99;
Phổ 1H-NMR
4,07; 4,34; 4,45; 4,64; 5,28 5,83; 5,84; 5,89;
5,93; 6,26; 6,65; 6,69  0,5 ppm
Phổ 13C-NMR có các độ chuyển dịch đặc
trưng: 38,4; 44,0; 45,5; 59,9; 61,5; 69,8; 72;
73,5; 75,2; 76,0; 76,3; 99,4; 100,9; 101,5;
13
104,8; 107,6; 110,7; 122; 123,8; 132,8; 135,3; Phổ C-NMR
136,8; 142,1; 146,6; 147,3; 149,9; 174,2  0,5
ppm
Mảnh đặc trưng m/z = 583,1409 (M+Na)+
Phổ HR-MS
Phương pháp
Không lớn hơn 5,0%
TGA
Không lớn hơn 0,1%
Tro sulfat
Từng tạp đơn: Không lớn hơn 3,0%
HPLC (Tính
Tổng tạp: Không lớn hơn 5,0%
bằng chuẩn hoá
diện tích)
Không được nhỏ hơn 95,0%

3.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính
cleisindoside A và 7’,8’-dehydrocleistantoxin (chất mới-CT1)
Bảng 3.34. Tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn định tính cleisindoside A
Chỉ tiêu và tiêu
chuẩn áp dụng
1.

Tính chất

2.

Nhiệt độ
nóng chảy

3.

Góc quay
cực riêng
Phổ UVVIS
Phổ hồng
ngoại (IR)

4.
Định
tính

5.
6.

Phổ cộng

đến
-53,0
𝐷
quay cực
(dung dịch 0,5% trong chloroform)
riêng
Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử 0,02 mg/ml Phổ hấp thụ
ACN trong khoảng từ 200 đến 400 nm có hai cực tử ngoại khả
kiến.
đại hấp thụ ở buớc sóng 203, 251 và 344  2 nm
Phổ IR trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có
Phổ hồng
các đỉnh đặc trưng trong khoảng: 3444, 2910, 1773,
ngoại
1626, 1491, 1244, 1382, 1080, 1034  20 cm-1
1
Phổ H-NMR có các độ chuyển dịch hoá học đặc
trưng: 7,04; 6,75; 6,54; 6,50; 6,37; 6,01; 6,02; Phổ 1H-NMR
5,95; 5,94; 5,02; 4,97; 4,89; 4,89; 4,63; 4,52 ; 4,36; (DMSO, 500
4,32; 4,25; 3,76; 3,46; 3,39; 3,12; 3,11; 3,03; 3,01;
MHz)
2,85  0,5 ppm
Phổ 13C-NMR có các độ chuyển dịch đặc trưng: 43,1;
13
60,9; 70,8; 73,4; 101,6; 102,5; 104,7; 108,3 110,5; 119,6; Phổ C-NMR
(DMSO,
125
123,8; 126,3; 128,4; 130,4; 139,9; 142,5; 145,6; 147,2;
MHz),
147,7; 148,5; 168,4  0,5 ppm

thử

Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong
dicloromethan, ACN và aceton, rất khó tan
trong MeOH và nước

Phương pháp
thử độ tan

Nhiệt độ 327OC đến 330OC
nóng chảy
O
O
Góc quay [𝛼]20
𝐷 = + 85,0 đến + 90,0
cực riêng (dung dịch 0,042% trong chloroform)
Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử 0,02
Phổ UV- mg/ml ACN có hai cực đại hấp thụ ở buớc sóng
VIS
203 và 286  2 nm
Phổ hồng
ngoại (IR)

4.
Định
tính

Yêu cầu

Phổ HRESIMS


Từng tạp đơn: Không lớn hơn 5,0%
HPLC
Tổng tạp: Không lớn hơn 10,0%
(Tính bằng
Độ tinh khiết sắc ký của chất chuẩn không được chuẩn hoá diện
tích)
nhỏ hơn 90,0%

TÓM LẠI:
Đã thiết lập được 2 chất chuẩn gốc định lượng là cleisindoside D (đóng 76
ống chuẩn khối lượng 10 mg, độ tinh khiết là 94,2%) và cleistantoxin (đóng 96
ống chuẩn khối lượng 10 mg, độ tinh khiết là 99,3%)
Đã chuẩn bị được 2 nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc định tính là cleisindoside
A độ tinh khiết sắc kí là 95,8% và 7’,8’-dehydrocleistantoxin 94,4%.
Vì vậy, cần tiến hành xây dựng phương pháp định tính cleisindoside A,
cleisindoside D, cleistantoxin, 7’,8’-dehydrocleistantoxin và định lượng
đồng thời cleisindoside D, cleistantoxin trong quả của chi Cách hoa
3.3. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ
ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ CỦA CHI CÁCH
HOA (CLEISTANTHUS)
3.3.1. Xây dựng phương pháp định tính đồng thời 4 lignan trong quả
của chi Cách hoa bằng HPLC/DAD.
Lựa chọn điều kiện sắc kí
- Lựa chọn cột sắc kí: Inertsil® ODS-3 C18 (250 x 4,6 mm; 5µm)
- Pha động: ACN : Nước

15




Tốc độ dòng
1,0 mL/phút
1,5 mL/phút
1,0 mL/phút
1,0 mL/phút
1,0 mL/phút

- Bước sóng: 286 nm
- Thể tích tiêm: 20 µL
Đã định tính được 4 chất cleisindoside A, cleisindoside D, cleistantoxin và
7’,8’-dehydrocleistantoxin trên SKĐ của mẫu thử quả Chà chôi và trong quả Cách
hoa eberhardt không có chất 7’,8’-dehydrocleistantoxin

Quả cây Chà chôi
Quả cây Cách hoa eberhardt
Hình 3.61. SKĐ định tính trong quả một số loài thuộc chi Cách hoa
3.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D và
cleistantoxin trong quả Chà chôi bằng HPLC/DAD.
Xây dựng qui trình chiết xuất cleisindoside D và cleistantoxin

Hình 3.47. Qui trình chiết cleisindosid D và cleistantoxin trong dược liệu

16


Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindosid D,
cleistantoxin bằng HPLC/DAD
Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH với các chỉ tiêu sau: độ
đặc hiệu, khoảng tuyến tính (r=0,9997>0,998), độ lặp lại, độ tái lặp (RSD%

có chứa chất CT1 cấu trúc và độ tan tương tự như cleistantoxin (Bảng 3.32)
nên khi kết tinh bằng hệ CH2Cl2: n-hexan thu được cleistantoxin lẫn với chất
CT1. Để tách cleistantoxin khỏi CT1, luận án sử dụng cột sắc kí silica gel
với hệ dung môi CH2Cl2 thêm aceton từ 1, 2, 5%….để loại các PĐ chứa CT1
và gom các PĐ chứa cleistantoxin thu được cắn B có độ tinh khiết
cleistantoxin là 87,8%. Sau đó, cắn B được kết tinh bằng CH2Cl2:n-hexan x
3 lần thu được chất cleistantoxin có độ tinh khiết rất cao (99,9%).
Đây là đóng góp mới của luận án đã phân lập, tinh chế lượng lớn chất
cleistantoxin (4,025 g) có độ tinh khiết rất cao (99,9%) so với nghiên cứu
thành phần hoá học trước đây. Qui trình phân lập, tinh chế đơn giản và ổn

17


định. Kết quả có tính thực tiễn, vì có thể áp dụng qui trình này để phân lập,
tinh chế cleistantoxin làm NLTLCC ở các lô khác có qui mô lớn hơn.
4.1.3. Phân lập, tinh chế, khẳng định cấu trúc cleisindoside D làm chất
chuẩn gốc định lượng
Dựa trên độ tan của cleisindoside D tan tốt trong CH2Cl2 và MeOH (Bảng
3.22), cắn D được phân lập trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH
(90:10) thu các PĐ chứa cleisindoside D thu được cắn E có hàm lượng
cleisindoside D là 85,8%. Để tinh chế cleisindoside D từ cắn E và loại bớt
các glycoside gắn 2 đến 3 phân tử đường, luận án đã lựa chọn sắc kí rây phân
tử hạt sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH 100%, thu được cắn F chứa
cleisindoside D có độ tinh khiết SK là 94,0% nhưng vẫn có màu vàng nên
cần tiếp tục tinh chế. Lựa chọn sắc kí pha đảo cột C18 với hệ dung môi
aceton-H2O (2-8) loại bỏ các glycoside cấu trúc gần giống cleisindoside D,
thu được các PĐ chứa cleisindoside D. Sau đó, kết tinh lại bằng hệ CH2Cl2:
n-butanol, cleisindoside D thu được có độ tinh khiết SK 97,6%.
Qui trình phân lập, tinh chế cleisindoside D khá công phu, thu được lượng


Trong quá trình thiết lập chất chuẩn gốc theo hướng dẫn của ISO 17034
và ISO GUIDE 35, sau khi chuẩn bị nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc,
cần xây dựng tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng nguyên liệu thiết lập chất
chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D. Theo hướng dẫn của
IP, USP và WHO, luận án đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn
gốc định lượng bao gồm: bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc như tính chất,
nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, bộ phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HRMS, IR và UV-VIS và xác định độ tinh khiết (hàm lượng) của chất chuẩn
gốc bằng phương pháp cân bằng khối lượng, được tính qua độ tinh khiết sắc
kí và hàm lượng TCLQ trong cleistantoxin/cleisindoside D bằng
HPLC/DAD, hàm lượng tạp chất bay hơi bằng TGA và tạp chất vô cơ.
Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc định lượng
cleistantoxin và cleisindoside D
Khi thiết lập chất chuẩn gốc theo hướng dẫn của IP, WHO, USP thì cần xây
dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc. Từ kết quả khẳng định cấu trúc các
chất cleistantoxin và cleisindoside D bằng phổ 1D, 2D-NMR, HR-MS, IR, UVVIS, CD…cho thấy bộ phổ của 2 chất phân lập được trùng với bộ dữ liệu đã công
bố của 2 chất cleistantoxin và cleisindoside D. Từ đó, xây dựng bộ dữ liệu nhận
dạng chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D gồm: tính chất,
nhiệt nóng chảy, góc quay cực riêng, bộ phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HR-MS, IR và
UV-VIS dựa trên các tài liệu đã công bố và các kết quả thực nghiệm của luận án
Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc
định lượng cleistantoxin và cleisindoside D
 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng TCLQ trong chất
chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D bằng HPLC/DAD
Hoạt chất cleistantoxin và cleisindoside D là hai hoạt chất mới chưa có
nghiên cứu nào xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và định
lượng các TCLQ trong cleistantoxin và cleisindoside D bằng HPLC/DAD.
Dựa trên cấu trúc hoá học và độ tan của chất nghiên cứu, sắc kí phân bố pha
đảo được lựa chọn: cột phenyl (250 x 4,6 mm; 5μm) và cột C18 (250 x 4,6 mm;
5μm) và nhiều hệ pha động. Tất cả các chương trình khảo sát đã phát hiện và

cleistantoxin và 5,0% chất chuẩn gốc cleisindoside D. Giới hạn cho phép về độ
tinh khiết sắc kí của chất chuẩn gốc cleistantoxin không được nhỏ hơn 99,5% và
chất chuẩn gốc cleisindoside D không được nhỏ hơn 95,0%.
 Phương pháp xác định hàm lượng tạp chất bay hơi trong chất chuẩn
cleistantoxin và cleisindoside D bằng kĩ thuật phân tích nhiệt lượng (TGA).
Luận án sử dụng kĩ thuật TGA để xác định tạp chất bay hơi, giảm lượng
chất sử dụng (10-20 mg) so với mất khối lượng do làm khô (1-2g), phù hợp
hơn khi thiết lập chất chuẩn. Tiến hành trên thiết bị TGA đặt chương trình ở
nhiệt độ 105oC trong vòng 4 giờ, cho kết quả tổng tạp chất bay hơi của 2 chất
chẩn gốc cleistantoxin và cleisindoside D lần lượt là 0,56 và 3,50%. Từ đó đưa
ra, giới hạn cho phép của tạp chất bay hơi không được lớn hơn 1,0% đối với chất
chuẩn gốc cleistantoxin và 5,0% chất chuẩn gốc cleisindoside D.
 Phương pháp xác định hàm lượng tạp chất vô cơ trong chất chuẩn
cleistantoxin và cleisindoside D bằng phép thử tro sulfat
Để định lượng tổng lượng tạp chất vô cơ, theo các hướng dẫn của IP,
WHO và USP khi thiết lập chất chuẩn gốc sử dụng kĩ thuật tro sulfat (Sulfat
Ash) hoặc cắn sau nung (ROI). Luận án đã sử dụng phương pháp tro sulfat
dùng acid sulfuric để vô cơ hoá mẫu trước sau đó đem nung ở 800oC đến khối
lượng không đổi, nên cắn thu được là tổng tạp chất vô cơ. Kết quả hàm lượng
tổng tạp vô cơ trong cả 2 chất chuẩn gốc nhỏ khoảng 0,07%. Từ đó đưa ra,
giới hạn cho phép của tạp chất vô cơ không được lớn hơn 0,1%.
Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng
cleistantoxin và cleisindoside D
Từ bộ dữ liệu nhận dạng và phương pháp xác định độ tinh khiết của chất
chuẩn gốc bằng phương pháp cân bằng khối lượng đã xây dựng tiêu chuẩn
cho chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D gồm yêu cầu kĩ
thuật và phương pháp thử của đầy đủ các chỉ tiêu: tính chất, nhiệt độ nóng chảy,
góc quay cực riêng, bộ phổ IR và UV-VIS, 1H-NMR, 13C-NMR, HR-MS, độ
tinh khiết sắc kí và hàm lượng TCLQ trong cleistantoxin/cleisindoside D
bằng HPLC/DAD, hàm lượng tạp chất bay hơi và tạp chất vô cơ (mục

các dữ liệu đầy đủ của tài liệu đã được công bố trùng với dữ liệu phổ khẳng
định cấu trúc chất phân lập được là cleisindoside A.
Đối với nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định tính 7’,8’dehydrocleistantoxin, đây là chất lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên nên
chưa có công bố nào về bộ dữ liệu tính chất, nhiệt độ nóng chảy, góc quay
cực riêng, bộ phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HR-MS, IR và UV-VIS của chất
7’,8’-dehydrocleistantoxin. Luận án là công trình đầu tiên đã xây dựng toàn
bộ các dữ liệu nhận dạng chất chuẩn mới này.
Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí của chất
chuẩn định tính cleisindoside A và 7’,8’-dehydrocleistantoxin
Phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí của chất chuẩn định tính
cleisindoside A dựa trên chương trình SK định lượng đồng thời cleisindoside D
và cleistantoxin trong quả Chà chôi và của chất chuẩn định tính 7’,8’dehydrocleistantoxin theo chương trình SK xác định độ tinh khiết sắc kí của
cleistantoxin. Phương pháp được thẩm định: độ đặc hiệu, LOD và độ lặp lại.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
định tính cleisindoside A và 7’,8’-dehydrocleistantoxin

21


Yêu cầu kĩ thuật và phương pháp thử của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
định tính cleisindoside A và 7’,8’-dehydrocleistantoxin được xây dựng dựa
trên bộ dữ liệu nhận dạng và phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí của
chất chất chuẩn bằng HPLC/DAD. Tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu
thiết lập chuẩn định tính 7’,8’-dehydrocleistantoxin và cleisindoside A là
đóng góp mới của luận án và đáp ứng được yêu cầu thực tiễn.
Bên cạnh đó, khi xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết SK của
chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D, cleistantoxin và định lượng đồng
thời cleisindoside D và cleistantoxin là trong quả của chi Cách hoa, cần có
dung dịch phân giải để đánh giá khả năng tách của cleisindoside D,
cleistantoxin khỏi các TCLQ. Nên luận án đã đóng ống chuẩn phân giải gồm

MeOH-H2O với các tỉ lệ khác nhau (9:1), (3:1) và (1:1). Hàm lượng (%) của

22


cleistantoxin và cleisindoside D cao nhất ở hệ MeOH-H2O (9:1) và MeOH-H2O
(3:1). Vì qui trình chiết xuất cần phải cô đến cắn nên hệ dung môi MeOH-H2O
(9:1) được lựa chọn vì có tỉ lệ nước thấp nhanh cô đến cắn hơn.
- Khảo sát kĩ thuật chiết
Khảo sát các kỹ thuật chiết xuất siêu âm, hồi lưu và chiết Soxhlet bằng dung
môi MeOH-H2O (9-1) để chiết xuất đồng thời cleisindoside D và cleistantoxin
trong quả Chà chôi, kết quả cho thấy chiết Shoxlet trong 2,5 giờ có hiệu xuất
chiết cao nhất. Luận án đã tiến hành kiểm tra sau 2,5 giờ chiết Soxhlet đã chiết
kiệt được 2 chất trên. Qui trình chiết xuất đã được nghiên cứu khoa học, công
phu và là đóng góp mới và có ý nghĩa thực tiễn của luận án.
4.3.3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính và định lượng
một số lignan trong quả của chi Cách hoa bằng HPLC/DAD
Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính 4 lignan: cleisindoside
A, cleisindoside D, cleistantoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin trong quả của
chi Cách hoa từ 4 chất chuẩn đã được thiết lập.
Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng đồng thời cleisindoside D
và cleistantoxin trong các mẫu của quả Chà chôi và Cách hoa eberhardt. Sơ bộ
xác định hàm lượng hoạt chất cleisindoside D và cleistantoxin trong mẫu quả
Chà chôi là 0,28 và 0,556% là cao nhất. Kết quả này định hướng các nhà khoa
học Viện HL KH&CN VN lựa chọn quả Chà chôi để làm nguyên liệu chiết xuất
cao khô để thử hoạt tính trên chuột Nude.
KẾT LUẬN
Luận án đã đạt được các mục tiêu đã đề ra.
1. PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA
CLEISTANTOXIN VÀ CLEISINDOSIDE D