BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
N VĂN HOÀN

HỒ VĂN SƠN

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN CIZ1b,
VEGF VÀ ĐỘT BIẾN EGFR VỚI NHIỄM VIRUS
MERKEL CELL Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI
KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN VĂN HOÀN
HỒ VĂN SƠN

N VĂN HOÀN
NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN CIZ1b,
VEGF VÀ ĐỘT BIẾN EGFR VỚI NHIỄM VIRUS

175, Trung tâm tư vấn di truyền và sàng lọc ung thư (CGC), Trung tâm nghiên
cứu y học Việt Đức (VG-CARE), Khoa Sinh học phân tử (C17) bệnh viện Trung
ương Quân đội 108 và các cơ quan chức năng đã tạo mọi điều kiện cho tôi học
tập và thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với GS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn và TS.
Ngô Tất Trung, hai thầy hướng dẫn khoa học, đã tận tụy dành thời gian, trí
tuệ, công sức giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn chỉnh luận án.
Tôi chân thành cảm ơn Trung tâm chẩn đoán và điều trị ung bướu, Khoa
Sinh hoá Bệnh viện Quân y 175 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Nhân dịp này chúng tôi chân thành cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã
ủng hộ, động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi dành tình cảm biết ơn sâu sắc tới gia đình, bố mẹ và vợ con đã luôn
động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận án.
TP Hồ Chí Minh 03/2020

Hồ Văn Sơn


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...........................................................................................
MỤC LỤC.....................................................................................................
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...........................................................
DANH MỤC BẢNG.....................................................................................
DANH MỤC HÌNH.....................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................
CHƯƠNG 1....................................................................................................
TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................
1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới.....................................................
1.1.2. Tuổi và giới...........................................................................................
1.1.3. Tỷ lệ tử vong..........................................................................................

virus Merkel cell..................................................................................
CHƯƠNG 2.................................................................................................
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu.......................................................
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ..............................................................................
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu.............................................................................
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.......................................................
2.2.3. Phương pháp chọn mẫu......................................................................
2.2.4. Phương pháp thu thập số liệu.............................................................
2.3. Định lượng mRNA bằng kỹ thuật real-time PCR.............................
2.4.1. Lấy mẫu xét nghiệm............................................................................
2.4.2. Vật liệu, hóa chất................................................................................
2.4.3. Thiết bị, máy móc................................................................................
2.4.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch RNA.............................................
2.4.5. Phương pháp tổng hợp cDNA.............................................................
2.4.6. Phương pháp đo quang phổ kế xác định nồng độ, độ tinh sạch
cDNA.................................................................................................
2.4.7. Phương pháp xác định mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b
và VEGF huyết tương.......................................................................
2.5.1. Tách DNA từ mẫu sinh thiết đúc paraffin (FFPE) bằng bộ sinh


phẩm Gene JET FFPE DNA Purification Kit...................................
2.5.2. Thực hiện phản ứng real-time PCR bằng bộ sinh phẩm EGFR
Mutation Detection Kit.....................................................................
2.5.3. Phân tích kết quả.................................................................................
2.6. Phương pháp phát hiện MCV.............................................................
2.6.1. Phát hiện MCV huyết tương và trong mô bằng phương pháp realtime PCR...........................................................................................
2.7.1. Chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ.........................................
2.7.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA VEGF, mRNA CIZ1b, đột

ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phản ứng real-time PCR........
3.7.3. Kết quả xác định dương tính với MCV bằng phản ứng PCR..............
3.7.4. Kết quả giải trình tự và so sánh đoạn giải trình tự với trình tự
MCV trên dữ liệu NCBI....................................................................
3.7.5. Tỷ lệ nhiễm MCV ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ và nhóm chứng người bình thường............................................
3.8.1. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với các
rối loạn tế bào máu ngoại vi.............................................................
3.8.2. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với rối
loạn hoạt độ men gan........................................................................
3.8.3. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với rối
loạn nồng độ Glucose máu...............................................................
3.8.4. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với mô
bệnh học của khối u..........................................................................
3.8.5. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với độ
biệt hóa của khối u............................................................................
3.8.6. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với
giai đoạn của bệnh............................................................................
3.8.7. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với đột
biến gen EGFR..................................................................................
3.8.8. Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với
các chỉ số cận lâm sàng....................................................................
3.9.1. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với giai đoạn bệnh và độ biệt
hoá tế bào khối u trong ung thư phổi không tế bào nhỏ...................
Bảng 3.38. Mối liên quan giữa giai đoạn bệnh và nhiễm MCV..............
Bảng 3.39. Mối liên quan giữa độ biệt hoá tế bào khối u và nhiễm
MCV.....................................................................................................
3.9.2. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với các đặc điểm cận lâm sàng
..........................................................................................................
3.9.3. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với marker ung thư..........................

4.2.4. Tỷ lệ nhiễm MCV ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ
trong nghiên cứu.............................................................................
4.3. Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b,
VEGF, đột biến EGFR với nhiễm virus Markel cell và một số
triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư phổi
không tế bào nhỏ................................................................................


4.3.1. Mối liên quan giữa biểu hiện gen CIZ1b với lâm sàng và cận lâm
sàng ở ung thư phổi không tế bào nhỏ............................................
4.3.2. Hiệu quả chẩn đoán của CIZ1b trong ung thư phổi..........................
4.3.3. Mối liên quan giữa biểu hiện gen VEGF với lâm sàng và cận lâm
sàng của ung thư phổi.....................................................................
4.3.4. Kiểu gen VEGF và tiên lượng điều trị ung thư phổi.........................
4.4. Mối liên quan giữa tình trạng nhiễm MCV và ung thư phổi..........
KẾT LUẬN................................................................................................
KIẾN NGHỊ..............................................................................................
DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN...................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................
PHỤ LỤC.....................................................................................................

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

ALK



CIZ1b

Biến thể b của Protein Cip1-interacting zinc finger

COPD

Chronic obstructive pulmonary disease (Bệnh phổi tắc nghẽn
mạn tính)

CT

Computed Tomography (chụp cắt lớp vi tính)

CEA

Carcinoma Embryonic Antigen

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EGFR

epidermal growth factor receptor (gen mã hóa thụ thể yếu tố
tăng trưởng biểu bì - EGFR)

ELISA

Enzyme linked immuno sorbent assay (Xét nghiệm miễn


National Center for Biotechnology Information (Trung tâm
quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)

PCR

Polymerase chaine reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PET

Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp bằng phóng
xạ)

PSA

Prostate-specific antigen (Kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền
liệt)

ROC

Receiver Operating Characteristic (đường cong đặc trưng
hoạt động của bộ thu nhận)

cDNA

complementary Deoxyribonucleic Acid


RNA


VEGF

Vascular Endothelial Growth Factor (Yếu tố tăng trưởng nội
mô mạch máu)

VEGFR

Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (thụ thể của
yếu tố tăng trưởng nội mạch - VEGFR)

WHO

World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi nguyên phát (UTPNP) là một trong những bệnh lý ác tính
thường gặp nhất hiện nay và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các

Đột biến Epidermal growth factor receptor (EGFR) đóng vai trò hết sức
quan trọng trong cơ chế bệnh sinh UTP và là đích phân tử có giá trị trong việc
điều trị. Mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời gian sống
thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân UTPKTBN.
Vai trò của truyền nhiễm trong UTP đã được nghiên cứu và chứng
minh, trong đó có vai trò của nhiễm virus như Human papillomavirus (HPV),
Epstein-Barr virus (EBV) và gần đây là nhiễm Virus Merkel cell (Merkel cell
Carcinoma virus - MCV). Các nghiên cứu cho thấy có sự liên quan rõ rệt giữa
nhiễm MCV với nguy cơ UTPKTBN và đột biến EGFR.
Tuy nhiên, ở nước ta giá trị của biểu hiện gen CIZ1b, VEGF và đột biến
EGFR với tình trạng nhiễm MCV trong UTP nói chung và UTPKTBN nói
riêng chưa được nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF và đột biến EGFR
với nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ”
với mục tiêu:
1. Đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, đột biến EGFR
và tỷ lệ nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân UTPKTBN.
2. Phân tích mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b,
VEGF, đột biến EGFR với nhiễm virus Merkel cell và một số triệu chứng lâm
sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đại cương về ung thư phổi
1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới
Ung thư phổi hiện nay vẫn là loại phổ biến nhất cả về tần suất mắc

* Tuổi
Các nghiên cứu nhận thấy ở tuổi càng cao thì nguy cơ mắc bệnh càng
cao [6]. Theo tác giả de Groot P. M. và cs (2018) thì bệnh thường gặp ở 55-74
tuổi (chiếm 53%) [6]. Tuổi trung bình cho cả nam và nữ là 70, có 37% mắc
UTP là trên 75 tuổi [6]. Có 10% bệnh nhân UTP tuổi dưới 55 [6]. Tuy nhiên
người ta nhận thấy UTP đang có xu hướng trẻ hóa, đã có các nghiên cứu về
UTP ở lứa tuổi 20-46, nhất là ung thư biểu mô tuyến. Đặc biệt là ở nữ giới và
không liên quan đến thuốc lá. Việc UTP có xu hướng trẻ hóa, nhất là không


5

liên quan đến thuốc lá có lẽ liên quan đến mối tương tác giữa yếu tố gen và
môi trường sống [6].
* Giới
UTP thường gặp ở nam nhiều hơn nữ. Tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ
thay đổi theo địa lý và thời gian. Theo Global cancer statistics 2018, Tại Đông
Âu tỷ lệ nữ /nam 1/4, Bắc Âu 1/1,3 , Đông Á 1/1,8, Tây Á 1/5, Bắc Mỹ tỷ lệ
này là 1/ 1,3, Nam và Trung Mỹ 1/1,6, Nam Phi 1/3 [1].
Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTP cũng đang có xu hướng cân bằng giữa
nam và nữ, theo Globocan cancer statistics 2018 tỷ lệ nam/nữ là 2,5/1 [1].
1.1.3. Tỷ lệ tử vong
UTP là nguyên nhân tử vong hàng đầu trong các bệnh ác tính trên thế
giới ở cả nam và nữ với số tử vong hàng năm chiếm gần 1/5 (18,4%) trong số
tử vong do các bệnh ung thư [1]. Năm 2018, toàn thế giới có khoảng 2,1 triệu
người mắc mới UTP trong đó có khoảng 1,8 triệu trường hợp tử vong, chiếm
18,4% tổng số tử vong do ung thư [1]. Số tử vong do UTP năm 2018 nhiều
hơn tổng số tử vong do ung thư vú, tụy, tiền liệt tuyến và cũng nhiều hơn tổng
số tử vong do ung thư gan và ung thư dạ dày [1]. Tỷ lệ tử vong do UTP đứng
đầu số tử vong do ung thư ở nam và đứng thứ 2 ở nữ sau ung thư vú [1]. Ở

1.1.5.2. Sợi Amian
Amian là những sợi silicat rất nhỏ và nhẹ mà mắt người không thể nhìn
thấy được. Tiếp xúc với amian gây ra những nguy cơ nghiêm trọng về loạn
sản biểu mô và UTP . Mối liên quan giữa tiếp xúc với amian và UTP đã được
chứng minh. Những người thường xuyên tiếp xúc với amian có nguy cơ mắc
UTP cao gấp 5 lần người thường. Nhưng những người thường xuyên tiếp xúc
với amian mà hút thuốc lá thì nguy cơ phát triển UTP càng tăng [6].
1.1.5.3. Khí Radon


7

Khí Radon là một khí trơ, sản phẩm phân rã tự nhiên của uranium và là
một nguyên nhân quan trọng gây UTP sau hút thuốc lá. Radon là nguyên nhân
gây nên khoảng 10% các trường hợp UTP. Nếu ở trong môi trường có Radon
và hút thuốc lá thì UTP có nguy cơ tăng cao [6],[8]. Nghiên cứu của Gaskin J.
và cs (2012) cho thấy Radon là nguyên nhân gây tử vong cho khoảng 3%
bệnh nhân UTP [8].
1.1.5.4. Ô nhiễm không khí
Ô nhiễm không khí liên quan đến UTP đã được đề cập từ năm 1920 của
thế kỷ trước. Ô nhiễm không khí làm tăng các sản phẩm carcinogens: PAH,
sulfur dioxide, metal…Nếu sống trong môi trường ô nhiễm không khí kéo dài
(khí thải công nghiệp...) có thể làm tăng nguy cơ UTP gần 50%. Nếu môi
trường ô nhiễm cộng với khói thuốc lá, nguy cơ này càng tăng cao [6].
1.1.5.5. Các tác nhân truyền nhiễm
UTP có liên quan chặt chẽ tới quá trình viêm và nhiễm trùng kéo dài. Ở
người nhiễm lao nguy cơ bị UTP tăng 1,76 lần so với người bình thường [6].
Human immunodeficiency virus (HIV) cũng đóng vai trò quan trọng
trong sự phát triển UTP. HIV tác động vào các gen ung thư (oncogenes) và hệ
miễn dịch làm tăng nguy cơ UTP. Người ta nhận thấy có khoảng 30% bệnh

Các tế bào ác tính phát triển do tích lũy các biến đổi về gen dẫn tới
hàng loạt các sự kiện tiến triển của ung thư bao gồm: gia tăng các tín hiệu
tăng trưởng, suy giảm các tín hiệu ức chế sinh trưởng, trốn chết theo chương
trình, tái bản vô hạn, mất kiểm soát sự tăng sinh mạch, xâm lấn và di căn [11].
Trong số các biến đổi về mặt di truyền, các đột biến hình thành ung thư như
đột biến gen tiền ung thư và gen ức chế khối u được quan tâm nghiên cứu
nhằm mang lại các công cụ chẩn đoán và điều trị căn bệnh này một cách hữu
hiệu.


9

Hình 1.2. Tăng sinh mạch (angiogensis) là một trong sáu đặc điểm nổi bật
của tế bào ung thư
* Nguồn: theo Hanahan D. và cs (2011) [11]

1.2.1. Gen gây ung thư (oncogene) trong ung thư phổi
Gen tiền ung thư (proto-oncongen) khi bị biến đổi trở thành gen ung
thư (oncogene). Các gen ung thư thường là các yêu tố tăng trưởng, thụ thể của
các yếu tố này, hay là các thành phần nằm trong con đường tín hiệu của
chúng. Dưới đây là một số gen ung thư thường gặp trong UTP.
1.2.1.1. Gen ung thư dung hợp Anaplastic lymphoma kinase -ALK
Gen ALK nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 2 (2p23), thuộc họ
siêu thụ thể insulin và mã hóa cho protein ALK, một thụ thể tyrosine kinase
xuyên màng. Các đột biến ở gen ALK gây ra ung thư thường được hình thành
do sự chuyển đoạn của nhiễm sắc thể làm cho gen ALK kết hợp với các gen
khác tạo ra gen ung thư dung hợp được biểu hiện quá mức.
Gen dung hợp ALK chiếm tỉ lệ 5 – 6% các ca bệnh UTPKTBN [12].
Các nghiên cứu thống kê cho thấy, tuổi trung bình của bệnh nhân UTPKTBN
có gen dung hợp ALK là 55 và khoảng 70% số bệnh nhân này chưa bao giờ

Mất chức năng gen ức chế khối u là một tính năng quan trọng trong


11

phát sinh ung thư, vì các gen này được coi là yếu tố điều chỉnh tiêu cực của sự
tăng trưởng. Sự bất hoạt các gen ức chế khối u phải diễn ra theo hai bước xảy
ra trên cả hai allen. Mất tính dị hợp (LOH) do mất đoạn hay chuyển đoạn
nhiễm sắc thể thường là bước thứ nhất làm mất đi một bản copy, trong khi đó
bản copy thứ hai bị biến đổi bởi đột biến điểm. Tuy nhiên các thay đổi về di
truyền ngoại gen như methyl hóa quá mức hay sự biến mất cả hai allen cũng
có thể gây mất chức năng của gen ức chế ung thư [19].
Các gen ức chế khối u thường có chức năng kiềm chế sự phát triển và
phân chia tế bào không phù hợp, kích thích sự chết theo chương trình để giữ
cho các tế bào ở trạng thái cân bằng hợp lý, cũng như liên quan đến quá trình
sửa chữa DNA, giúp ngăn ngừa sự tích lũy các đột biến trong các gen liên
quan đến ung thư [20]. Theo cách này, các gen ức chế khối u hoạt động như
yếu tố kìm hãm (phanh) để ngăn chặn các tế bào theo dõi trước khi chúng có
thể đi đến ung thư.
1.2.2.1. Gen p53
Gen p53 mã hóa cho một protein trong nhân có khối lượng 53 kDa,
nằm trên nhiễm sắc thể 17p13. Gen này có chức năng ngăn chặn sự tích lũy
các sai hỏng ở các tế bào sau phân chia. Gen p53 hoạt động như một yếu tố
phiên mã điều khiển các gen đích liên quan đến tín hiệu điểm kiểm tra G1 của
chu trình tế bào, sửa chữa DNA, hoặc chết theo chương trình [19]. Các đột
biến p53 xảy ra ở toàn bộ khung đọc, phần lớn là các đột biến thay thế một
gốc axit amin. Tuy nhiên các đột biến dịch khung, chèn, mất và cắt nối cũng
có thể xuất hiện. Ở UTP, 70 – 100% bệnh nhân UTP tế bào nhỏ có đột biến
này, trong khi ở bệnh nhân UTPKTBN là khoảng 50%. Cũng giống như đột
biến KRAS, đột biến p53 thường xảy ra ở người có liên quan đến hút thuốc lá