BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HUỲNH NHƯ TUẤN

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY
ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TUYẾN TỤY IN VITRO
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ NỤ VỐI
[Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry]
THU HÁI Ở QUẢNG NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HUỲNH NHƯ TUẤN

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY
ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TUYẾN TỤY IN VITRO
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ NỤ VỐI
[Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry]

Học viên

Huỳnh Như Tuấn


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về cây Vối ................................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố.................................................................. 3
1.1.1.1. Tên gọi và vị trí phân loại ................................................................. 3
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................. 3
1.1.1.3. Phân bố ............................................................................................. 4
1.1.1.4. Bộ phận dùng .................................................................................... 4
1.1.2. Thành phần hóa học ................................................................................. 4
1.1.2.1. Flavonoid .......................................................................................... 4
1.1.2.2. Tinh dầu ............................................................................................ 8
1.1.2.3. Triterpenoid ...................................................................................... 8
1.1.2.4. Các hợp chất khác .......................................................................... 10
1.1.3. Tác dụng dược lý ................................................................................... 11
1.1.3.1. Độc tính tế bào ................................................................................ 11
1.1.3.2. Tác dụng chống tăng đường huyết .................................................. 12
1.1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ................................................ 13
1.1.3.4. Tác dụng kháng virus ...................................................................... 13
1.1.3.5. Tác dụng chống oxy hóa ................................................................. 13
1.1.3.6. Tác dụng chống viêm ...................................................................... 14
1.1.4. Độc tính.................................................................................................. 14

2.3.2.3. Phương pháp phân tích quá trình tự chết tế bào (apoptosis) ......... 26
2.3.2.4. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào (cell cycle arrest) ............... 27
2.3.3. Xử lý số liệu ........................................................................................... 28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 29


3.1. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nụ Vối
.............................................................................................................................. 29
3.1.1. Điều chế cao chiết tổng và các cao chiết phân đoạn .............................. 29
3.1.2. Phân lập các hợp chất từ nụ Vối ............................................................ 30
3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tuỵ in vitro trên
2 dòng tế bào PANC-1 và MIA PACA-2 của các hợp chất phân lập được .. 40
3.2.1. Thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh tế bào ........................................ 40
3.2.2. Thử nghiệm kích hoạt caspase-3............................................................ 41
3.2.3. Thử nghiệm phân tích quá trình tự chết tế bào (apoptosis) ................... 43
3.2.4. Thử nghiệm phân tích chu kỳ tế bào ...................................................... 44
Chương 4. BÀN LUẬN .......................................................................................... 46
4.1. Về chiết xuất, phân lập một số hợp chất ................................................... 46
4.2. Về đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tuỵ in vitro của các
hợp chất phân lập được ..................................................................................... 47
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
δ

CC



EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

GF254

Gypsum fluorescent 254 nm

FBS

Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum)

IC50

Nồng độ ức chế 50% (Half maximal Inhibitory Concentration)

J

Hằng số tương tác

MeOH

Methanol

OD


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Các hợp chất chalcon được phân lập từ cây Vối.

5

Bảng 1.2.

Các hợp chất flavanon được phân lập từ cây Vối.

6

Bảng 1.3.
Bảng 1.4.
Bảng 1.5.

Các hợp chất flavon, flavonol, dihydroflavonol
được phân lập từ cây Vối.
Các hợp chất terpenoid được phân lập từ cây Vối.
Một số hợp chất kháng tế bào PANC-1 được phân
lập từ các cây thuốc Việt Nam.



Bảng 3.3.

Số liệu phổ NMR của CO3

35

Bảng 3.4.

Số liệu phổ NMR của CO4

37

Bảng 3.5.

Số liệu phổ NMR của CO5

38

Kết quả đánh giá hoạt tính chống tăng sinh tế bào
Bảng 3.6.

ung thư tụy của các hợp chất phân lập được từ nụ

40

Vối
Bảng 3.7.

Kết quả thử nghiệm kích hoạt caspase-3 trên tế bào

4

Hình 1.2.

Các hợp chất chalcon được phân lập từ cây Vối.

5

Hình 1.3.

Các hợp chất flavanon được phân lập từ cây Vối.

6

Hình 1.4.

Các hợp chất flavon, flavonol, dihydroflavonol được
phân lập từ cây Vối.

7

Công thức cấu tạo của triterpenoid khung ursan (A),
Hình 1.5.

olean (B), lupan (C), taraxastan (D) và multiflorane

8

(E)
Hình 1.6.

Hình 3.2.

Sơ đồ phân lập hợp chất CO1 và CO2.

30

Hình 3.3.

Sơ đồ phân lập hợp chất CO3 và CO4.

31

Hình 3.4.

Sơ đồ phân lập hợp chất CO5.

32

Hình 3.5.

Cấu trúc hoá học của hợp chất CO1.

34

Hình 3.6.

Cấu trúc hoá học của hợp chất CO2.

35


của DMC ở các nồng độ khác nhau sau khi ủ 12 giờ,

42

24 giờ và 48 giờ.
Tác động của hợp chất DMC (CO1) lên quá trình tự
Hình 3.12.

chết (apoptosis) của tế bào PANC-1 ở nồng độ 3 µM,

43

10 µM và 30 µM.
Kết quả phân tích hàm lượng DNA của quần thể tế
Hình 3.13.

bào PANC-1 khi xử lý với DMC 3 µM, 10 µM và 30
µM

45


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư tuyến tụy là một loại khối u ác tính thường gặp có tần suất xuất hiện
ngày càng tăng trên thế giới. Do tỷ lệ xâm lấn hủy hoại cao và phát triển âm thầm
với rất ít biểu hiện hay triệu chứng, ung thư tuyến tụy được đánh giá là một trong
những bệnh ung thư nguy hiểm. Các phương pháp điều trị chủ yếu cho bệnh nhân
ung thư tuyến tụy như phẫu thuật, hóa trị và xạ trị có nhiều nhược điểm lớn như tác
động xấu lên các cơ quan, tấn công, làm hư hại các tế bào khỏe mạnh khác trong cơ
thể cùng hàng loạt tác dụng phụ bao gồm rụng tóc, buồn nôn, chán ăn, mệt mỏi, sức

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Vối
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.1.1.1. Tên gọi và vị trí phân loại
• Tên khoa học: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry [20]
• Tên đồng nghĩa: Syzygium nervosum DC. [19], Eugenia operculata Roxb.
[30]
• Tên Việt Nam: Vối nhà, Trâm nấp, Mạy xả (Tày)
Theo công bố của tạp chí thực vật Blumea năm 2006, chi Cleistocalyx chính
thức được sát nhập vào chi Syzygium dựa trên các dữ liệu hình thái và phân tử [19].
Vị trí của chi Syzygium trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Sim (Myrtales)
Họ Sim (Myrtaceae)
Phân họ Sim (Myrtoideae)
Tông Trâm (Syzygieae)
Chi Syzygium R.Br. ex Gaertn. [16]
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây Vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-6 m, có khi lên đến 15 m, vỏ thân nứt nẻ,
màu nâu đen. Cành, nhánh có nhiều vẩy. Lá đơn mọc đối, có cuống ngắn, phiến lá
hình trứng rộng, hai mặt có những đốm màu nâu. Hoa nhỏ màu lục trắng nhạt, gần
như không cuống, hợp thành cụm hoa dạng chùy rộng, mọc ở kẽ những lá đã rụng.
Nụ hoa hình bầu dục, lá bắc dễ rụng. Đài dính vào bầu. Hoa đều, lưỡng tính, 4 cánh
hình tròn hay hình bầu dục, nhiều tuyến mờ dính lại ở đỉnh thành mũ hình chóp. Nhị
nhiều, rời nhau. Bầu nằm sâu trong ống đài, bị nhị che kín. Quả hình cầu hay hơi

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của 7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylisoflavon

4


• Các hợp chất chalcon được phân lập chủ yếu từ nụ Vối, với đặc điểm là nhóm
thế gắn vào 2 vòng thơm có cấu tạo đa dạng, tuy nhiên, nhiều nhất vẫn là 2 nhóm –
OH và –CH3 (bảng 1.1 và hình 1.2). Trong đó, hợp chất (3), tên viết tắt là DMC, có
nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý. Hợp chất (8) có cấu tạo glycosid với phần đường
gắn ở vị trí C4’ của phần aglycon qua liên kết O-glycosid.
Bảng 1.1. Các hợp chất chalcon được phân lập từ cây Vối.
Ký hiệu
2
3
4
5
6
7
8

Tên hợp chất
(E)-4,2′,4′-trihydroxy-6′-methoxy-3′,5′dimethylchalcon
2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′dimethylchalcon
2′,4′-dihydroxy-3′-methyl-6′-methoxychalcon
2,2′,4′-trihydroxy-6′-methoxy-3′,5′dimethylchalcon
3′-formyl-4′,6′-dihydroxy-2′-methoxy-5′methylchalcon
3′-formyl-4′,6′,4-trihydroxy-2′-methoxy-5′methylchalcon
3′-formyl-6′,4-dihydroxy-2′-methoxy-5′methylchalcon 4-O-β-D-glucopyranosid

Bộ phận


Hình 1.2. Các hợp chất chalcon được phân lập từ cây Vối.
• Những nghiên cứu của Zhang F. và cs. (1990), Ye C. và cs. (2004), Byung S.
M. và cs. (2008), Đào Trọng Tuấn và cs. (2010), Hà Thị Kim Quy và cs. (2016) đã
phân lập được 11 hợp chất flavanon từ nụ và lá Vối (bảng 1.2 và hình 1.3). Các nhóm
thế chủ yếu gắn trên nhân thơm cạnh vòng dihydropyron, trong đó –OH và –OCH3

5


thường ở vị trí 5 và 7. Duy nhất hợp chất (19) là dạng glycosid với phần đường gắn
ở vị trí C7 của phần aglycon qua liên kết O-glycosid.
Bảng 1.2. Các hợp chất flavanon được phân lập từ cây Vối.
Ký hiệu

Tên hợp chất

Bộ phận

TLTK

9
10

(2S)-8-methylpinocembrin
(2S)-5,7-dihydroxy-6,8-dimethylflavanon
(2S)-5-hydroxy-7-methoxy-6,8dimethylflavanon
(2S)-6-formyl-8-methyl-7-O-methylpinocembrin
(2S)-7-hydroxy-5-methoxy-8-methylflavanon
(2S)-8-formyl-5-hydroxy-7-methoxy-6methylflavanon

Nụ

[22]

Nụ

[22],[75]

Nụ

[49]

Nụ

[49]

11
12
13
14
15
16
17
18
19

Hình 1.3. Các hợp chất flavanon được phân lập từ cây Vối.

6



Nụ
Nụ, lá
Nụ, lá
Nụ

[22]
[22],[48]
[22],[48]
[48]

Nụ, lá

[27],[48]

Nụ, lá

[27],[48]

Nụ, lá

[22]

Hình 1.4. Các hợp chất flavon, flavonol, dihydroflavonol được phân lập
từ cây Vối.

7


1.1.2.2. Tinh dầu

Ký
hiệu
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37

Tên hợp chất
Khung ursan
Acid ursolic
Acid corosolic
Acid asiatic
Acid actinidic
Acid 2α-hydroxymicromeric
Acid 2α,3β,11α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic
Acid 2α,3β-dihydroxy-24-nor-urs-4(23),12-dien28-oic
Acid 2α,3β,11α,23-tetrahydroxyurs-12,20(30)dien-28-oic
Acid 2α,3β,23-trihydroxy-11α-methoxyurs12,20(30)-dien-28-oic
Acid 2α,3β,23-trihydroxy-11-oxours-12,20(30)dien-28-oic
3β,22β-dihydroxyurs-20-ene-27,28-dioic acid 28methyl este
Khung olean

38

[70]
[70]
[70]
[70]
[70]

Lá

[70]

Lá

[70]

Lá

[70]

Lá

[70]

Lá

[70]

Lá, nụ
và hoa
Lá, nụ
và hoa


[70]

Lá

[70]

Lá

[70]


47
48
49
50
51
52
53
54
55

Khung lupan
Betulin
Acid betulinic
Acid alphitolic
Khung taraxastan
Acid 3β-hydroxytaraxast-20-en-28-oic
3β,21α-Dihydroxytar-axast-28,20β-olid
Acid 3β-hydroxytaraxast-20-en-27-al-28-oic

[70]

1.1.2.4. Các hợp chất khác
Các nghiên cứu của Trương Thị Tố Chinh và cs. [5], Hà Thị Kim Quy và cs.
[27] đã phân lập được thêm một số hợp chất khác từ lá Vối, như 1-tetratriacontanol
(56); (2S)-2,6-dihydroxy-4-methoxy-5,7-dimethylcoumaran-3-on (57); 2,4¢,6¢trihydroxy-2¢-methoxy-3¢,5¢-dimethylacetophenon (58) và 3-O-methylellagic acid4¢-O-α-L-rhamnopyranosid (59).

(56)

(57)

(58)

(59)

Hình 1.6. Các hợp chất khác được phân lập từ lá Vối.

10


Thành phần của nụ Vối còn có ethyl gallat, acid gallic, β-sitosterol và acid
cinamic [2], [78].
1.1.3. Tác dụng dược lý
Nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng sinh học của cây Vối dựa trên
những mô hình dược lý hiện đại dưới sự hỗ trợ của khoa học kỹ thuật. Mục đích của
những nghiên cứu này nhằm chứng minh tác dụng chữa bệnh của dược liệu theo kinh
nghiệm dân gian hoặc là một giai đoạn của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới.
Vì thế ngày càng có nhiều tác dụng sinh học của cây Vối được công bố. Một số tác
dụng sinh học đáng quan tâm của các loài thuộc loài này được trình bày dưới đây.
1.1.3.1. Độc tính tế bào

este (53) thể hiện độc tính đối với các dòng tế bào ung thư HepG2, NCIN87, MCF7
với giá trị IC50 dao động từ 3,2 đến 6,5 µM và 3β-hydroxyolean-13(18)-ene-27,28dioicacid 28-methyl este (46) kháng lại các tế bào HepG2 và NCIN87 với giá trị IC50
khoảng 5,0 µM [70].
Gần đây nhất, nhóm nghiên cứu Trần Mạnh Hùng và cs. đã xác định khả năng
ức chế tế bào ung thư tuyến tuỵ của dịch chiết ethanol 70% từ nụ Vối trên 2 dòng tế
bào PANC-1 và MIA PACA-2 với giá trị IC50 lần lượt là 28,4 ± 4,5 µM và 38,5 ±
3,7 µM; trong khi dịch chiết ethanol 70% từ lá Vối thể hiện khả năng ức chế yếu hơn
trên 2 dòng tế bào này với giá trị IC50 lần lượt là 98,5 ± 6,5 µM và 30,5 ± 2,1 µM [8].
1.1.3.2. Tác dụng chống tăng đường huyết
Một số nhà nghiên cứu của Việt Nam đã chỉ ra rằng, dịch chiết nước từ nụ Vối
có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và có khả năng điều trị tiểu đường qua thử
nghiệm in vitro và in vivo [46], [47].
Nhiều nghiên cứu tập trung làm rõ tác dụng chống tăng đường huyết của hợp
chất DMC (3) phân lập từ nụ Vối. Theo công bố của Yingdi Luo và Yanhua Lu
(2012), DMC có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 chống lại sự tự chết tế bào (apoptosis)
thông qua việc tăng cường chức năng của ty thể và là một thuốc tiềm năng cho việc
chăm sóc bệnh nhân tiểu đường type 2 [45]. DMC còn cho thấy hoạt tính ức chế
mạnh α-amylase ở tụy nhưng không hiệu quả đối với α-glucosidase ở ruột, bảo vệ sự
tiết insulin bị suy giảm gây ra bởi tình trạng “ngộ độc đường” trong tế bào β tuyến
tụy [31], [32]. Một số nghiên cứu khác cho thấy DMC làm tăng sự hấp thu glucose

12


và sự oxy hóa acid béo trong các bó cơ, ức chế sự biệt hóa tế bào mỡ ở tế bào 3T3L1 [33], [21].
1.1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Các nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng kháng khuẩn của lá và nụ Vối trên một số
chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus diphtheriace, B. subtilis, Staphylococcus
aureus) và Gram âm (Escherichia coli, Streptococcus hemolyticus) [2], [7].
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Dung và cs. (2008), nồng độ ức chế

264,7 được kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS) [25].
Năm 2015, Wanguo Yu và cs. đã chứng minh DMC (3) có tác dụng kháng
viêm bằng cách làm giảm TNF-α, IL-1β, và IL-6 và HMGB thông qua việc can thiệp
đường truyền tín hiệu PI3K-PDK1-PKCα [77].
1.1.4. Độc tính
Bên cạnh những nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học của nụ và lá Vối,
nghiên cứu đánh giá tính an toàn của loài cây này cũng đã được thực hiện. Năm 1968,
Nguyễn Đức Minh thuộc phòng Đông y thực nghiệm Viện nghiên cứu Đông y đã
xác định giá trị LD50 là 7830 mg/kg khi thử trên chuột nhắt trắng bằng đường uống
và đi đến kết luận rằng lá và nụ Vối hoàn toàn không có độc đối với cơ thể [10].
1.1.5. Công dụng, bài thuốc
1.1.5.1. Công dụng
Từ xưa, nụ và lá vối đã được nhân dân Việt Nam nấu nước uống vừa thơm
vừa có tác dụng tiêu cơm, nhuận tràng. Liều dùng hàng ngày: 10 - 20g. Lá vối tươi
hay khô sắc đặc là thuốc sát trùng dùng rửa mụn nhọt, lở loét, ghẻ [2], [3], [10]. Lá,
vỏ thân, hoa còn chữa đầy bụng, ỉa chảy, viêm đại tràng mạn, lị trực trùng [3].
1.1.5.2. Bài thuốc
• Bài thuốc chữa tiêu chảy [2]:
- Lá Vối 3g, vỏ rộp cây Ổi 8g, núm quả Chuối tiêu l0g, thái nhỏ phơi khô, sắc với
400 ml nước còn l00 ml, chia làm 2 lần uống trong ngày.
- Vỏ Vối 100g, vỏ Sung 100g, lá Ổi 100g, lá Phèn đen 100g, vỏ cây Đại 50g, hạt Vải
50g, Quế 30g. Tất cả phơi khô, tán thành bột mịn, luyện với hồ làm thành viên to
bằng hạt đậu xanh. Người lớn ngày uống 12g, chia làm 2 lần. Trẻ em tùy theo tuổi
giảm liều.

14