BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ MỸ LINH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG
ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
THÂN CÂY DÂU TẰM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ MỸ LINH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG
ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
THÂN CÂY DÂU TẰM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1.Về thực vật ...................................................................................................... 3
1.2.Thành phần hóa học ........................................................................................ 4
1.3. Tác dụng sinh học ........................................................................................ 11
1.4. Công dụng .................................................................................................... 15
1.5. Độc tính cấp ................................................................................................. 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất, dung môi ................................................................................... 16
2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ .................................................................... 17
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 17
2.2.1. Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ
thân dâu tằm ........................................................................................................ 17
2.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết methanol
và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm .................................... 18
2.2.3. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ thân dâu tằm .................... 18
2.2.4. Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các hợp chất phân
lập được ............................................................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
2.3.1. Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ
thân dâu tằm ........................................................................................................ 19



creatin kinase

COX

cyclooxygenase

d

doublet

DC

dịch chiết

DPPH

1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl

HDL

high density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao)

IC50

inhibitory concentration of 50% (nồng độ ức chế 50% đối
tượng thử)

J


phần triệu

RBC

red blood cell (số lượng hồng cầu)


s

singlet

SKLM

sắc ký lớp mỏng

TBARS

thiobarbituric acid reactive substances (chất phản ứng của
acid thiobarbituric)

VLDL-C

very low density lipoprotein cholesterol (lipoprotein tỷ
trọng rất thấp


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro

23

của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi
thân và vỏ thân dâu tằm
3.3

Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
của acid ursolic, oxyresveratrol và kuwanon G

31


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình

Trang

2.1

Ảnh chụp thân cây dâu tằm

16

2.2

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu


Cấu trúc hóa học của hợp chất Me04: Kuwanon G

31

4.1

Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu phát triển thuốc từ

34

dược liệu với cách tiếp cận phân lập theo định hướng tác
dụng sinh học


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong quá trình sinh tổng hợp acid uric, xanthin oxidase được coi là enzym
chìa khóa do xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và phản ứng
oxy hoá xanthin thành acid uric. Do đó, các chất ức chế xanthin oxidase - điển
hình là allopurinol đang được sử dụng phổ biến trong lâm sàng để điều trị bệnh
gút và các bệnh có liên quan đến tăng acid uric máu [116]. Tuy nhiên, nhược
điểm của hợp chất này là các tác dụng không mong muốn, đặc biệt là phản ứng
quá mẫn và không hiệu quả trong điều trị cơn gút cấp vì không có tác dụng
chống viêm [111]. Vì vậy, việc tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính ức chế
xanthin oxidase và khắc phục được những nhược điểm kể trên của allopurinol là
cần thiết, trong đó các hợp chất tự nhiên là đối tượng đáng chú ý và được quan
tâm nghiên cứu trong những năm gần đây.
Cây Dâu tằm có tên khoa học là Morus alba L., thuộc họ Dâu tằm
(Moraceae), là loại cây được trồng phổ biến ở nhiều nơi để làm thức ăn cho tằm,
lấy quả, làm thuốc. Các bộ phận của cây dâu tằm như lá (tang diệp), quả (tang

được.

2


PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Về thực vật
1.1.1. Vị trí phân loại chi Morus
Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [133], chi Morus có vị trí phân
loại như sau:
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan)
Phân lớp: Dilleniidae (Sổ)
Bộ: Urticales (Gai)
Họ: Moraceae (Dâu tằm)
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Morus
Cây bụi, rụng lá, có nhựa mủ; đơn tính cùng gốc hoặc khác gốc. Đâm chồi
vào mùa đông, có 3-6 vảy chồi xếp đè lên nhau, có lá kèm. Lá có nhiều hình
dạng; mép lá nguyên hay xẻ thùy sâu, có răng cưa; gân lá hình lông chim, có từ
3-5 gân nhỏ từ gân chính. Hoa đực mọc ở nách lá, mọc thành dạng bông, có
nhiều hoa, cuống ngắn; có 4 cánh, xếp đè lên nhau; nhị hướng vào trong. Hoa
cái mọc thành dạng bông hay đầu, không cuống; có 4 cánh xếp đè lên nhau, bầu
nhụy 1 ô; núm nhụy xẻ đôi, có lông tơ hoặc nốt sần. Đài hoa mọng nước tạo
thành quả tụ. Hạt hình cầu, có nội nhũ, phôi hướng vào trong, có lá mầm hình
elip [29].
Trên thế giới, chi Morus có khoảng 16 loài, phân bố rộng rãi ở khu vực ôn
đới, miền núi nhiệt đới châu Phi, Indonesia và Nam Mỹ [29].
Ở Việt Nam, chi Morus có 5 loài và gần như tất cả đều đã được đưa vào
trồng trọt. Đó là các loài: Morus alba L. (dâu tằm), Morus nigra L. (dâu quả

Bảng 1.1. Các hợp chất polyphenol trong thân và cành dâu tằm

STT

Tên hợp chất

1

Quercetin

Cấu trúc hóa học

TLTK

[65]

4


STT

Tên hợp chất

Cấu trúc hóa học

2

6-Geranylapigenin

[65]


[117]

8

Oxyresveratrol

[16],
[65],
[117]

5

TLTK


STT

Tên hợp chất

Cấu trúc hóa học

TLTK

9

Resveratrol

[65],
[117]

[21]

[21]
3

Moruslanosteryl acetat

6


STT

Tên hợp chất

4

α-amyrin acetat

Cấu trúc hóa học

TLTK

[21]

[21]
5

β-amyrin-β-Dglucopyranosid

6


Bộ phận

TLTK

Lá
Lá

[46], [71]
[42]

Flavonoid
1
2

Astragalin
Atalantoflavon

7


STT
Tên hợp chất
3 Benzyl D –glucopyranosid
4 Cyclomulberrin
3′, 8-Diprenyl-4′, 5, 7-trihydroxyflavon
5
6
7
8

7-Hydroxyl-8-hydroxyethyl-4′-methoxyl
flavan-2′-O-β-D-glucopyranosid
8-Hydroxyethyl-7, 4′-dimethoxylflavan2′-O-β-D-glucopyranosid
Isoquercitrin
Kaempferol
7-Methoxyl-8-ethyl-2′, 4′-dihydroxyl
flavan-2′′-O-β-D-glucopyranosid
7-Methoxyl-8-hydroxyethyl-2′, 4′dihydroxyl flavan
7-Methoxyl-8-hydroxyethyl-4′-hydroxyl
flavan-2′-O-β-D-glucopyranosid
Morachalcon C
Morachalcon B
Roseosid II
Scopolin
Skimmin
Kuwanon S
Sanggenons K
Sanggenons J
Quercetin
Sanggenons J
6-Geranylapigenin
Rutin
Cyclomorusin
Morusin
5,2'-dihydroxyflavanon-7,4'-di-O-β-Dglucosid
Kuwanon A
Kuwanon B
Kuwanon C
Kuwanon E
Kuwanon G

Lá

[46], [71], [78]
[42], [148], [6]

Lá

[148]

Lá

[148]

Lá

[148]

Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá, quả
Lá, quả
Lá, vỏ rễ

[107], [149]
[149]
[112]
[149]


STT
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58

Cyanidin 3-O-(6′′-O-αrhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosid)
Cyanidin-3-O-p-coumarylglucosid

Bộ phận

TLTK

Rễ

[81]

Vỏ rễ
Quả
Quả
Quả
Quả
Quả
Quả
Quả

[107]
[102]
[137]
[137]
[137]
[137]
[102]
[102]

Quả


Quả

[47]

Quả

[47]

Quả

[5]

Rễ, lá

[1], [27]

Rễ

[27]

Rễ
Quả
Quả

[27]
[83]
[83]

Quả

76
77
78
79
80

Tên hợp chất
Morrol B
Morrol C
Morrol E
Morrol G
Morrol H
Acid 2-(5-hydroxymethyl-2formylpyrrol-1-yl) propionic lacton
Acid 2-(5-hydroxymethyl-2formylpyrrol-1-yl)isovaleric lacton
Methyl 2-[2-formyl-5-(methoxymethyl)1H-pyrrol-1-yl]-3-(4-hydroxyphenyl)
propanoat
4-(Formyl-5-(hydroxymethyl)-1Hpyrrol-1-yl) butanoat
Acid 4-(Formyl-5-(methoxymethyl)-1Hpyrrol-1-yl) butanoic
2α, 3β-Dihydroxynortropan
2β, 3β-Dihydroxynortropan
3β, 6-exo-Dihydroxynortropan

Bộ phận
Quả
Quả
Quả
Quả
Quả

TLTK

[83]
[83]
[83]

Rễ

[121]

Rễ

[149]

Rễ

[149]

Rễ

[121]

Vỏ rễ
Vỏ rễ
Vỏ rễ
Vỏ rễ

[149]
[149]
[149]
[149]



89
90
91

Acid 3-O-caffeoylquinic
Acid ellagic
Acid gentisic
10


STT
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109

Mulberrofuran K
Steppogenin

Bộ phận
Quả
Quả
Quả
Quả
Quả
Lá, quả
Quả
Quả
Lá, quả
Lá, quả
Lá, quả
Lá, quả
Lá, quả
Lá, quả
Lá, quả
Lá, quả
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá

TLTK

RAE liều 400 mg/kg có tác dụng hạ acid uric huyết với I% là 24,28 %; trong khi
allopurinol 10 mg/kg (tiêm phúc mạc) có tác dụng hạ acid uric huyết với I% là
47,62 % trên chuột tăng acid uric gây bởi kali oxonat (p < 0,05). Tại nồng độ
200 µg/ml, dịch chiết ethanol của quả ức chế 21,4 % hoạt tính xanthin oxidase,
trong khi allopurinol 200 µg/ml có giá trị ức chế I% là 68,2 % [30], dịch chiết
nước và dịch chiết ethanol 70 % có giá trị I% tương ứng là 100 % và 96,2 % ở
11


nồng độ 1000 µg/ml [157]. Dịch chiết methanol 70 % của lá liều 400 mg/kg có
tác dụng hạ acid uric máu 45,9 % trên chuột khỏe mạnh [45].
1.3.2. Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết chứa flavonoid của lá, vỏ thân, lá non và cành dâu tằm có tác
dụng dọn gốc tự do O2- với IC50 tương ứng là 5,3, 4,3, 3,1 và 1,5 µg/ml. Dịch
chiết flavonoid 5 µg/ml của cành có khả năng ức chế 85,5 %, cao hơn so với
rutin 5 µg/ml và acid ascorbic 5 µg/ml ức chế tương ứng 52,0 và 38,2 % [156].
Khả năng dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết ethanol của cành tốt hơn so với vỏ
rễ [33].
Dịch chiết lá dâu tằm có tác dụng khả năng ức chế quá trình peroxid hóa
acid linoleic [12], lipid [135], dọn gốc tự do DPPH [25], [31], [137], ức chế
TBARS ở gan chuột béo phì [72] và đưa các trị số SOD, CAT, GPx, GSH về giá
trị bình thường trên chuột được tiêm isoprenalin [45], [135], [137].
Dịch chiết quả dâu tằm có tác dụng dọn gốc tự do DPPH [152] và gốc
hydroxyl [152]. Chế độ ăn chứa bột quả giúp làm giảm nồng độ TBARS, RBC
và SOD trong máu và gan trên mô hình chuột béo phì do chế độ ăn [145].
Dịch chiết ethanol và dịch chiết nước vỏ rễ dâu tằm có khả năng dọn gốc tự
do DPPH và ức chế gốc nitric oxid [157] làm giảm nồng độ paraoxonase và chất
phản ứng của acid barbituric (TBARS) trong máu trên chuột béo phì [49] .
Các hợp chất emaclurin, rutin, isoquercitrin, resveratrol và morin có mặt
trong cành có tác dụng ức chế gốc tự do, các ion phức và peroxid hóa lipid. [33].

dòng tế bào ung thư gan Hep G2. [52].
Các hợp chất quercetin–3–O-β-D-glucopyranosid và quercetin-3,7–di–Oβ-D-glucopyranosid được chiết từ lá dâu tằm có tác dụng ức chế dòng tế bào
ung thư máu HL 60 và ức chế hoạt động của topoisomerase II [73].
7, 2', 4', 6'-tetrahydoroxy-6-geranylflavanon phân lập từ rễ có tác dụng ức
chế dòng tế bào ung thư gan dRLh84 [81]. Hợp chất 5,2'-dihydroxyflavanon7,4'-di-O-β-D-glucosid (steppogenin-7,4'-di-O-β-D-glucosid) phân lập từ vỏ rễ
dâu tằm có tác dụng ức chế u nang buồng trứng HO-8910 [93]. Các flavonoid
(3′-geranyl-3-prenyl-2′,4′,5,7-tetrahydroxyflavon, 3′,8-diprenyl-4′,5,7-trihydroxy
flavon, kuwanon S, 8-geranylapigenin, cyclomulberrin, sanggenon J và K,
cyclomorusin, morusin, atalantoflavon và kaempferol) phân lập từ dịch chiết

13


methanol của lá dâu tằm có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa,
ung thư vú MCF–7 và ung thư gan Hep3B [2], [42].
1.3.5. Tác dụng đối với lipid máu
Dịch chiết ethanol của quả và lá dâu tằm có tác dụng giảm nồng độ
triglycerid và cholesterol máu, tăng nồng độ HDL huyết thanh đồng thời làm
giàm sự tích lũy mỡ ở gan và cải thiện tình trạng stress oxy hóa trên động vật
béo phì và đái tháo đường[19], [32], [36], [49], [56], [60], [136], [80], [109],
[113] [151]. Trên bệnh nhân rối loạn lipid nhẹ, dịch chiết nước lá dâu tằm có tác
dụng hạ triglycerid máu và LDL, nồng độ protein phản ứng C và tăng nồng độ
HDL [82].
Mulberrosid A và oxyresveratrol được phân lập từ dịch chiết ethanol rễ dâu
tằm có tác dụng hạ cholesterol, LDL và tăng nồng độ HDL (p < 0,05) trong máu
ở chuột rối loạn lipid máu do chế độ ăn giàu chất béo và do Triton WR-1339
[67].
1.3.6. Tác dụng tăng cường miễn dịch
Dịch chiết methanol lá dâu tằm (MRA) với liều 100 mg/kg (uống) làm tăng
globulin huyết thanh. Ngoài ra, MRA liều 100 mg/kg có tác dụng ức chế quá

hoa mắt Cành dâu (tang chi) dùng chữa phế nhiệt sinh ho, ho ra máu, bụng
trướng, đau nhức xương khớp, chân tay co duỗi khó khăn. Quả dâu (tang thầm)
dùng chữa bệnh tiêu khát, mắt có màng, tai ù, huyết hư, bí tiểu tiện [4], [10].
1.5. Độc tính cấp
Đánh giá độc tính cấp cho thấy không có biểu hiện gây độc trên chuột ở
liều 2000 mg/kg của dịch chiết methanol (tương đương 90,9 g lá) [144] và liều
5000 mg/kg dịch chiết ethanol của lá dâu tằm 5000 mg/kg [20].

15


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu nghiên cứu là thân cây dâu tằm được thu hái tại xã Song Mai, thành
phố Bắc Giang vào tháng 8 năm 2016.
Mẫu cây có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phòng Tiêu bản - Bộ môn
Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là
HNIP/18484/17. Căn cứ vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, đối
chiếu với khóa phân loại của Thực vật chí Trung Quốc [155] đã xác định tên
khoa học của mẫu nghiên cứu là Morus alba L., họ Dâu tằm (Moraceae).
Thân cây dâu tằm sau khi thu hái, tách riêng vỏ thân và lõi thân. Lõi thân
được thái mỏng, vỏ thân được cắt thành những đoạn ngắn 1-2 cm, sấy khô,
bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát.
Ảnh chụp mẫu dâu tằm nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1.

Phần lõi thân dâu tằm

Phần vỏ thân dâu tằm