BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THÚY

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT
STILBENOID VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG ỨC
CHẾ COX-2 IN VITRO CỦA CÂY NHO RỪNG
(Vitis heyneana Roem. & Schult.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THÚY

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT
STILBENOID VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG ỨC
CHẾ COX-2 IN VITRO CỦA CÂY NHO RỪNG
(Vitis heyneana Roem. & Schult.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè –
những ngƣời đã luôn ủng hộ tôi trong trong suốt quá trình học tập vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 4 năm 2018
Học viên
Phạm Thị Thúy


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

PHẦN 1: TỔNG QUAN

2

1.1. Về thực vật

2

1.1.1. Vị trí, phân loại và phân bố của chi Vitis

2

1.1.2. Đặc điểm thực vật loài nho rừng


1.3.4. Tác dụng kháng nấm

13

1.3.5. Tác dụng chống dị ứng

14

1.3.6. Tác dụng giảm đau, hạ sốt

14

1.3.7. Tác dụng chống loét dạ dày

14

1.3.8. Tác dụng chống ung thƣ

15

1.3.9. Tác dụng khác

15

1.4. Một số công dụng của nho rừng

16

2.



2.1.2. Hóa chất, dung môi

20

2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ

21

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

22

2.2.1. Chuẩn bị cao chiết cồn 96% và các cao chiết phân đoạn từ phần trên
mặt đất nho rừng

23

2.2.2. Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro của cao chiết toàn phần và
các cao chiết phân đoạn từ phần trên mặt đất nho rừng

23

2.2.3. Phân lập các hợp chất stilbenoid từ phân đoạn có hoạt tính của phần
trên mặt đất nho rừng

25

2.3.4. Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro của một số hợp chất phân
lập đƣợc

3.4.1. Hợp chất VH7

30

3.4.2. Hợp chất VH8

33

3.4.3. Hợp chất VH13

36

3.4.4. Hợp chất VH16

38


3.5. Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro của một số hợp chất phân lập
đƣợc

42

PHẦN 4: BÀN U N

45

4.1. Sàng lọc tác dụng ức chế COX-2 in vitro lựa chọn cao phân đoạn có
hoạt tính định hƣớng phân lập các hợp chất có tác dụng chống viêm

45

Catechin

COX-2

Cyclo oxygenase-2

CTCT

Công thức cấu tạo

DPPH

1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl

He La

Tế bào ung thƣ cổ tử cung (Henrietta Lacks)

HepG2

Tế bào ung thƣ gan ngƣời (Human hepatocellular liver
carcinoma cell line)

HMBC

Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear
Multiple Bond Connectivity)

HPLC



Mitogen-activated protein kinase

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory
Concentration)

mEq

Milliequivalent

MS

Phổ khối lƣợng phân tử (Mass Spectrometry)


NFκB

Nuclear factor-kappa B

NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

NSAIDS

Thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal antiinflammatory drugs)

SKLM/TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

Thuốc thử


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1

Danh sách các loài thuộc chi Vitis ở Việt Nam

2

Bảng 1.2

Một số hợp chất stilbenoid phân lập từ các loài thuộc chi

4

Vitis
Bảng 1.3

Một số hợp chất flavonoid đƣợc tìm thấy trong loài V.

8


33

α-viniferin
Bảng 3.4

Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của VH13 và cisvitisin B

36

Bảng 3.5

Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của VH16 và cisvitisin B

39

Bảng 3.6

Kết quả thử tác dụng ức chế COX-2 in vitro của
stilbenoid từ phần trên mặt đất cây nho rừng

42

Bảng 4.1

Một số tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc

49


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Sơ đồ chiết cao cồn 96% và các cao phân đoạn phần trên
mặt đất cây nho rừng Vitis heyneana Roem. & Schult

26

Hình 3.1

Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế COX-2 của cao cồn
96% và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất nho rừng
trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7

28

Hình 3.2

Sắc ký đồ dấu vân tay hóa học của phần trên mặt đất nho
rừng

29

Hình 3.3

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat
của phần trên mặt đất nho rừng

30

Hình 3.4

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH7

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm là một đáp ứng miễn dịch tự nhiên giúp bảo vệ cơ thể trƣớc sự tấn
công của các tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý) hoặc tác nhân bên
trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn). Nhƣ đã biết, 2 nhóm thuốc
chống viêm điển hình đang đƣợc sử dụng hiện nay là thuốc chống viêm không
steroid (NSAIDS) và thuốc chống viêm steroid (glucocorticoid) gây nhiều tác
dụng không mong muốn. Việc nghiên cứu tìm ra nguồn thảo dƣợc và các hợp
chất thiên nhiên ít tác dụng phụ và có tác dụng chống viêm là một trong những
hƣớng tiếp cận đang đƣợc quan tâm trong nền y dƣợc hiện nay.
Cây nho rừng có tên khoa học là Vitis heyneana Roem. & Schult., họ Nho
(Vitaceae), tên gọi khác là nho lông, nho năm góc. Rễ, vỏ rễ, lá đều là những vị
thuốc quý, đƣợc dùng để chữa nhiều bệnh nhƣ viêm phế quản, lậu hoặc dùng
ngoài trị đòn ngã tổn thƣơng, gân cốt tê đau, kinh nguyệt không đều, bạch đới,
phù thũng, sởi, lỵ…[8].
Các nghiên cứu về tác dụng sinh học trên thế giới chủ yếu tập trung trên 3
loài Vitis vinifera, Vitis amurensis và Vitis labrusca cho thấy có tác dụng chống
viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, hạ đƣờng huyết, bảo vệ gan, kháng khuẩn,
kháng nấm, giảm đau, hạ sốt…Trong đó, các stilbenoid và oligostilbenoid đƣợc
cho là nhóm chất đặc trƣng có liên quan đến tác dụng chống viêm của một số
loài thuộc chi Vitis.
Hiện nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng chống viêm
của loài Vitis heyneana Roem. & Schult. tại Việt Nam còn rất ít. Chính vì vậy,
chúng tôi xin tiến hành thực hiện đề tài “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất
stilbenoid và thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro của cây nho rừng
(Vitis heyneana Roem. & Schult.)” với 2 mục tiêu chính nhƣ sau:
1. Phân lập 3-5 hợp chất stilbenoid từ phần trên mặt đất nho rừng.
2. Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro của cao chiết tổng, cao chiết phân
đoạn và một số hợp chất phân lập đƣợc.

1

Vitis vinifera L.

Nho

Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh
Thuận, Bình Thuận,

âm Đồng,

TP. Hồ Chí Minh
2

Vitis labrusca L.

3

Vitis balansana Nho đất, nho Thái Nguyên, Hà Nội, Hải Dƣơng,
Planch.

Nho chồn

Việt Nam

dại nhỏ quả

Hải Phòng, Ninh Bình, Quảng Trị,
Huế, Đà Nẵng, Nha Trang, Khánh
Hòa

4

Ex Planch.
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài nho rừng
Nho rừng hay còn gọi là nho lông, nho năm góc, có tên khoa học là Vitis
heyneana Roem. & Schult. hoặc tên đồng nghĩa là Vitis pentagona Diels and
Gilg, Vitis quinquangularis Rehder, thuộc họ Nho (Vitaceae) [8].
Cây nhỡ leo, vòi đơn. Cành đo đỏ, phủ lông nhện, tựa bông, bị rụng nhiều
hay ít, tua cuốn đối diện với lá, rẽ đôi [8]. á đơn; xoan, thƣờng có 5 góc, cụt
hay hình tim ở gốc, lúc đầu nhƣ mạng nhện rồi sậm ở trên, có lông len nhiều và
có màu kem hay màu quế ở dƣới, dài 7-15 cm, rộng 7-11 cm, có 3 thùy, rõ hay
không, có răng rất ngắn. Hoa thành chùm đối diện với lá, dài 7-8 cm, rộng 3-5
cm, có lông nhện. Quả chín màu đen, nạc, đƣờng kính 1cm. Hạt 2-4, xoan
ngƣợc, dẹp [6], [7], [8], [71].
Sinh thái: cây thƣờng mọc trong rừng, sƣờn đồi hoặc thung lũng dƣới
dạng cây bụi, ra hoa tháng 5-6, có quả tháng 10-11 [8].
Phân bố: Cao B ng, Lạng Sơn, ào Cai, Ninh Bình vào Bình Thuận; còn
có ở Trung Quốc, Lào, Campuchia [8].
1.2. Thành phần hóa học
1.2.1. Thành phần hóa học của chi Vitis
Hiện nay, trên thế giới đã có khá nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học
các loài thuộc chi Vitis. Các kết quả nghiên cứu chủ yếu tập trung trên V.
vinifera, V. amurensis và V. balansana cho thấy chúng có chứa các hợp chất
thuộc nhóm stilbenoid, flavonoid, tanin, polysaccharid, acid amin và steroid.

3


1.2.1.1. Nhóm chất stilbenoid
Stilbenoid là nhóm hợp chất đặc trƣng của chi Vitis nói riêng và trong họ
Vitaceae nói chung. Đã có khoảng 100 stilbenoid dạng monomer, dimer hoặc
oligomer đƣợc tìm thấy từ các loài Vitis [60].

vinifera

(lá, thân, quả) [10],
1

(E)-Piceid

V. amurensis [48],

(13)

(lá, thân)
V.

larbusca [84],

(quả)

4

[76],


V.

vinifera

(lá, thân, quả)
2



4

(lá, thân)
V. thunbergii

Resveratrol

(lá, thân)

(7)

V.

[34],
[76]

vinifera

(lá, thân, quả)

trans-

[21],

larbusca

(lá, thân, quả)
V. heyneana


[48],
[76],


V. thunbergii
(rễ, thân)
V. amurensis

(+)7

(lá, thân, rễ

Ampelopsin

V.

A (6)

vinifera

(thân)
V. heyneana

[21],
[30],
[34],
[77],
[80]

(thân)


[36]

(thân)
V.

(+)-(E)-ε14

Viniferin
(28)

(lá, thân)

[30],

V. heyneana

[55]

(thân)

V.
15

vinifera

Hopeaphen

vinifera


r-2Viniferin
(1)

V. amurensis
(lá, thân)

(E)-Vitisin

V.

B (26)

(thân)

vinifera

[80]

[21]

[69]

1.2.1.2. Nhóm chất flavonoid và phenolic
Năm 1999, Yinrong Lu và cộng sự đã phân lập và xác định đƣợc 16 hợp
chất từ bã nho và đã xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc
dựa theo các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối
(MS ….Chúng gồm 6 hợp chất thuộc nhóm acid phenolic (acid gallic (30), acid
4-glucosid gallic (31), acid 3-glucosid gallic (32), trans-acid caftaric (33), transacid coutaric (34), cis-acid coutaric (35)), một hợp chất là dẫn xuất của hydroxy
phenol (2-hydroxy-5-(2-hydroxy-ethyl) phenylglucosid (36)) và 9 hợp chất
7

TLTK

V. labrusca,

[65]

V. vinifera

2

Quercetin (50)

V. labrusca,
V. vinifera

8

[65]


3

Rutin (51)

V. labrusca,

[65]

V. vinifera



58-77%

Palmitic

5-10%

Linolenic

≤ 1%

Stearic

3-5%

Arachidic

≤ 0,1%

Oleic

12-26%

Các sterol bao gồm 15 chất: cholesterol (53), brassicasterol (54), 24methylen cholesterol (55), campesterol (56), campestanol (57), stigmasterol
(58), ∆7-campesterol (59), ∆5,23-stigmastadienol (60), clerosterol (61), βsitosterol (62), sitostanol (63), ∆5-avenasterol (64), ∆5,24-stigmastadienol (65),
∆7-stigmasterol (66) và ∆7-avenasterol (67). [42].
1.2.1.4. Các thành phần khác
Nghiên cứu của Sónia O. Prozil

và cộng sự đã xác định đƣợc các

HO
OH

OH

HO

H
OH

H

O H

HO

H

HH
O

OH

19

20
OH

OH



68

69

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học một số oligostilbenoid phân lập từ V. heyneana
10


1.2.2.2. Nhóm chất megastigman glycosid
Năm 2012, từ cao chiết aceton 70% lá cây V. heyneana, Hai-Jian Cong và
cộng sự đã phân lập đƣợc 5 megastigman glucosid trong đó có một
megastigman glucosid mới là (3S,5R,6R,9R)-megastigman-3, 5, 6, 9-tetrol 9-Oβ-ᴅ-glucopyranosid (70) và 4 megastigman glucosid là actinidioionsid (71),
(6S,9R)-roseosid (72), icarisid B5 (73) và icarisid B1 (74) [17].
1.2.2.3. Một số thành phần khác
Năm 2013, Yue Li và cộng sự đã phân lập đƣợc 5 hợp chất từ rễ cây V.
heyneana, bao gồm β-sitosterol (62), aviculin (86), acid betulinic (87), benzyl Oβ-ᴅ-apiofuranosyl-(1→2 -β- ᴅ -glucopyranosid (88) và methyl rosmarinat (89)
[84].
Từ cao chiết lá cây V. heyneana, Hai-Jian Cong và cộng sự đã phân lập và
xác

định

đƣợc

1

cycloartan

nortriterpenoid

2,69 µM. Mặt khác resveratrol cũng ức chế hoạt động của COX-2 khá đáng kể
với IC50 = 27,01 ± 1,11µM [77].
Nghiên cứu của Bakhta Aouey và cộng sự năm 2016 cho thấy cao chiết
thủy phân lá V. vinifera với liều 100, 200 và 400 mg/kg làm giảm đáng kể thể
tích phù bàn chân chuột lần lƣợt là 34,48% (p
amurensis. Kết quả cho thấy cao chiết methanol quả V. amurensis có tác dụng
chống dị ứng theo cơ chế kháng histamin và kháng immunoglobulin E [43].
Nghiên cứu của Marzulli G. và cộng sự trên loài V. vinifera cho thấy cao
chiết V. vinifera làm giảm số lƣợng immunoglobulin E và bạch cầu ái toan trong
dịch phế quản chuột bị suyễn [54].
1.3.6. Tác dụng giảm đau, hạ sốt
Nghiên cứu của Bakhta Aouey và cộng sự năm 2016 cho thấy cao chiết
thủy phân lá V. vinifera có tác dụng giảm đau đáng kể. Khi cho chuột dùng liều
200 và 400 mg/kg và dùng indomethacin 10 mg/kg thì hiệu lực giảm đau tƣơng
ứng là 60,5%, 65,5% và 75,07% [12].
Cũng trong nghiên cứu này, Bakhta Aouey và cộng sự đã chứng minh cao
chiết thủy phân lá V. vinifera có tác dụng hạ sốt trên mô hình chuột thí nghiệm
sử dụng nấm men. Kết quả cho thấy ở liều 200 mg/kg và 400 mg/kg thì có tác
dụng hạ sốt tại 23 h lần lƣợt là 36,84°C và 36,76°C [12].
1.3.7. Tác dụng chống loét dạ dày
Nghiên cứu của Makoto Saito năm 1998 về tác dụng chống loét dạ dày
của cao chiết hạt nho cụ thể là procyanidin đƣợc tiến hành trên chuột, với liều
200 mg/kg procyanidin thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự tổn thƣơng niêm mạc
dạ dày gây bởi ethanol 60% có chứa 150 mM HCl [68].
Nghiên cứu của Ingale Anand và cộng sự cho thấy cao chiết hạt và vỏ nho
V. vinifera có tác dụng giảm đáng kể thể tích loét dạ dày và nồng độ acid tự do
so với nhóm đối chứng. Trong đó, nhóm dùng liều 200 mg/kg cao chiết hạt nho

14


có hiệu quả tốt nhất (thể tích loét dạ dày giảm 2,16 ± 0,19 ml, nồng độ acid tự
do còn 46,66 ± 0,98 mEq/l/100g, ức chế loét 68,38%) [35].
1.3.8. Tác dụng chống ung thư
Y học cổ truyền Trung Quốc từ lâu đã sử dụng V. amurensis để điều trị


Bộ phận
dùng
Hạt

15

TLTK
[18]