Header Page 1 of 116.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
NGUYỄN BÍCH HẠNH
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN
(COPTIS CHINENSIS FRANCH)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2017
Footer Page 1 of 116.
Header Page 2 of 116.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
NGUYỄN BÍCH HẠNH
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN
(COPTIS CHINENSIS FRANCH)
tôi để tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Bích Hạnh
Footer Page 3 of 116.
Header Page 4 of 116.
A
ACh
AChE
ACTI
BuOH
CV
DTNB
EtOAc
EtOH
HCl
HPLC
IC50
IU
MeOH
NXB
pH
RSD
SD
Header Page 5 of 116.
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng
Bảng 3.2 Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên
chân gà và Berberin clorid
Footer Page 5 of 116.
Trang
27
28
Header Page 6 of 116.
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) ................................... .4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên .................... .7
Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE................................................ 14
Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên .............................. 20
Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng
thuốc thử Ellman ................................................................................................. 21
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro .............. 23
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro .. 25
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các
dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro ......................................... 15
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 19
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 19
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ................................................................................... 19
2.1.2. Hóa chất, dung môi .............................................................................. 19
2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ ............................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 19
2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE ...................... 19
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE...... 24
2.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 25
Footer Page 7 of 116.
Header Page 8 of 116.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................. 27
3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE ............................................... 27
3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE .............................. 30
3.3. Bàn luận .................................................................................................. 32
3.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in
vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32
3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym
Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. ............................ 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Footer Page 8 of 116.
Trên cơ sở đó, một vài phương pháp thử in vitro đã được xây dựng. Trong đó,
phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được sử dụng khá phổ biến
trong các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro. Đây cũng là
một hướng quan trọng và nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học
Footer Page 9 of 116.
1
Header Page 10 of 116.
trên thế giới và trong nước, đặc biệt đối với các thuốc có nguồn gốc dược liệu
[27,34].
Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, Hoàng liên là thân rễ phơi khô của
nhiều loại Hoàng liên chân gà như: Coptis chinensis Franch, Coptis teeta
Wall, Coptis teetoides C.Y Cheng, Coptis deltoidea C.Y Cheng et Hsisao,
Coptis quinquesecta… thuộc họ Hoàng liên – Ranunculaceae được biết đến
với nhiều công dụng như kháng khuẩn, chống virus, chống viêm... Ở Việt
Nam, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) được dùng khá phổ biến
trong các bài thuốc với nhiều tác dụng tốt. Gần đây, một số nghiên cứu cho
thấy hợp chất berberin và một số alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm năng
ức chế enzym AChE cao mở ra hướng mới trong điều trị bệnh Alzheimer.
Nhận thấy, trong dịch chiết của Hoàng liên cũng có chứa một lượng lớn các
alkaloid đặc biệt là berberin có tiềm năng lớn trong nghiên cứu phát triển
thuốc mới từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ Alzheimer.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức
chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng
liên (Coptis chinensis Franch)” với mục tiêu:
Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn
khoảng 8-12 noãn. Cây ra hoa từ tháng 10-12. Quả có màu đen từ tháng 12
đến tháng 4 năm sau, nhỏ, dài 6-7 cm, có cuống ngắn. Vào mùa xuân cây con,
chồi có thể tái sinh từ thân rễ [2,4,5,7,9].
Footer Page 11 of 116.
3
Header Page 12 of 116.
Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch)
1.1.2. Phân bố, trồng trọt và thu hái
Phân bố
Hoàng liên là loại cây thân thảo mọc hoang trên các đỉnh núi cao.
Trong cuốn “Thần Nông bản thảo kinh” (Trung Quốc) có viết Hoàng
liên là cây thuốc quý cao cấp, được xếp vào loại thượng phẩm, cây mọc ở trên
núi Thái Sơn có nhiều ở vùng Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam, Hồ Bắc, Triết
Giang [13,14].
Ở Việt Nam, Hoàng liên là loại cây thuốc hiếm thường mọc hoang ở
vùng núi có độ cao từ 1500 – 2000 m trong các khu rừng có nhiều cây cổ thụ
rậm rạp, ở nơi nửa sáng, nửa tối.
Footer Page 12 of 116.
4
Header Page 13 of 116.
nhất 3,5 % beberin (C20H18NO4. HCl) và 0,5% (C21H22NO4. HCl) palmatin
tính theo dược liệu khô kiệt [3].
Footer Page 13 of 116.
5
Header Page 14 of 116.
Trong cây, berberin tồn tại dưới dạng clohydrat. Hàm lượng alkaloid
thay đổi tùy theo vùng và thời kỳ sinh trưởng của cây. Ở Tứ Xuyên (Trung
Quốc), hàm lượng berberin cao nhất vào tháng 9 và 10, thấp nhất vào thời kỳ
cây ra hoa. Ngoài thân rễ, lá cũng chứa berberin, hàm lượng cao nhất ở lá già.
Ở Nhã Liên (Trung Quốc), hàm lượng berberin chứa 5% vào tháng 9-10. Lá
già chứa 2,5 – 2,8% berberin vào tháng 7-10 [4,7,9].
Ngoài ra, trong dịch chiết EtOH của Hoàng liên còn phân lập được 13 hợp
chất non-alkaloid như 7 hợp chất lignan, 3 phenylpropanoid đơn giản, 2 hợp chất
flavon và 1 hợp chất phenolic acid. Đó là các hợp chất: erythro-guaiacylglycerol8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl
alcohol) ether, (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-lariciresinol, (+)-5'methoxylariciresinol, (+)-isolariciresinol, chlorogenic acid, ferulic acid, Zoctadecyl caffeat, rhamnetin, wogonin, and vanillic acid [12].
Footer Page 14 of 116.
6
Header Page 15 of 116.
Công thức cấu tạo của một số alkaloid phân lập từ thân rễ Hoàng Liên
thể hiện ở hình 1.2.
Staphylococcus aureus [1,9].
Dịch chiết thô Hoàng liên có tác dụng ức chế ký sinh đường ruột
Blastocystis hominis rất mạnh với nồng độ 100 µg/ml [1].
Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn: berberin có khả năng ức chế quá trình
phiên mã và dịch mã tạo ARN và protein ở vi khuẩn. Các chất vitamin B6,
nicotinamid, acid p – aminobenzoic đều có tác dụng đối kháng với berberin.
Có hiện tượng kháng thuốc xảy ra khi dùng dài ngày berberin sulfat trên các
bệnh liên quan đến các chủng tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn tán huyết, trực
trùng lỵ, nhưng đối với bài thuốc có Hoàng liên như bài “Hoàng liên giải độc
thang” thì không có hiện tượng kháng thuốc, ngược lại tác dụng kháng khuẩn
lại mạnh hơn [7,9].
Dịch chiết nước Hoàng liên có khả năng ổn định phức hợp không bền
với enzym ADN topoisomerase I ở động vật có vú. Nghiên cứu cho thấy rằng
Footer Page 16 of 116.
8
Header Page 17 of 116.
hai tiền chất epiberberin và gloenlandicin của berberin là những tiểu phân
hoạt động có hoạt tính phân tách ADN qua trung gian topoisomerase I; song 2
alkaloid này lại không phân tách AND qua trung gian topoisomerase II. Chỉ
có tiền chất berberrubin (alkaloid loại protoberberin) là chất đặc hiệu phân
tách ADN qua trung gian topoisomerase II in vitro.
Những kết quả này cho thấy alkaloid gốc berberin là nhóm hợp chất có
khả năng tạo phức không bền với topoisomerase I và II [30].
Tác dụng kháng virus
Dịch chiết nước Hoàng liên thí nghiệm trên phôi gà có tác dụng ức chế
Header Page 18 of 116.
Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết nước của thân rễ Hoàng liên có tác
dụng ức chế Helicobacter pylori (H.pylori), ngăn ngừa và phòng tránh các
bệnh liên quan đến loét dạ dày- tá tràng; có so sánh với berberin và dịch
chiết Hoàng bá (Cortex Phellodendri). Tác dụng ức chế enzym urease tiết
ra bởi H.pylori và urease của đậu jack của dịch Hoàng liên cao hơn Hoàng
bá và berberin (với giá trị IC50 nhỏ hơn hẳn). Sự ức chế không cạnh tranh
của Coptis chinensis Franch có sự tương quan nồng độ và thời gian, có khả
năng giải ức chế bằng glutathion được cho là do sự tương tác của các hợp
chất trong dịch chiết với nhóm sulfhydryl của vị trí hoạt động trên enzym
urease [32,51].
Tác dụng chống viêm
Coptisin, thành phần chính của Coptis chinensis Franch, đã cho thấy
khả năng ức chế mạnh sản xuất oxit nitơ (NO) bằng cách ức chế protein và
các biểu hiện mARN của enzym tổng hợp oxi nitric (iNOS) trong
lipopolysaccharid (LPS) kích thích các đại thực bào RAW 264.7. Coptisin
cũng ức chế sản xuất các cytokin gây viêm là interleukin-1β (IL-1β) và
interleukin-6 (IL-6) bằng cách ức chế sự biểu hiện mARN của cytokin; đồng
thời ức chế sự thoái hoá của protein ức chế nhân tố nhân κBα (IκBα) và
phosphoryl hóa yếu tố điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK), c-Jun NH2terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), và
phosphoinositide 3-kinase/Akt (PI3K/Akt). Coptisin cũng ức chế sự xuất hiện
của TNF-α và NO trong các mô viêm ở chuột thí nghiệm.
Các kết quả này cho thấy coptisin trong Hoàng liên ức chế sự viêm LPS
bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt yết tố nhân κB, MAPK và PI3K / Akt trong
các đại thực bào có tác dụng chống viêm đặc hiệu [19,45].
Dịch chiết thân rễ Coptis chinensis Franch kích hoạt tế bào MOLT-4,
Th1, MAPK giúp tăng cường miễn dịch trong viêm, đóng vai trò như các chất
bổ trợ, bổ sung để điều trị trong suy giảm hệ thống miễn dịch [20].
Tác dụng chống oxy hóa
(HSL) đẩy nhanh quá trình phân giải triacylglycerol (TG) ở mô mỡ, có tác
dụng đáng kể trong giảm béo phì [16,29].
Trong dịch chiết Hoàng liên chứa Jatrorrhizin hydrochlorid (JH) được
nghiên cứu có khả năng ức chế hình thành lipid và tăng cường oxy hóa lipid
trong gan chuột thí nghiệm [43].
Tác dụng hạ đường huyết
Dịch chiết Hoàng liên làm giảm khả năng kháng insullin của tế bào
trong mô hình chuột Wistar bị đái tháo đường týp II gây ra bởi chế độ ăn giàu
chất béo và tiêm streptozotocin thông qua con đường ức chế c-Jun N terminal
kinase [24,37].
Tác dụng trên hệ thần kinh
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Hoàng liên cũng có tác dụng an thần,
chống trầm cảm, stress, tác dụng tốt trên hệ thần kinh. Berberin, jatrorhizin và
palmatin được phân lập từ dịch chiết MetOH của Hoàng liên Coptis chinensis
Footer Page 19 of 116.
11
Header Page 20 of 116.
Franch có tác dụng ức chế MAO (monoaminoxidase- enzym xúc tác quá trình
phân hủy chất dẫn truyền thần kinh monoamin).
Jatrorrhizin ức chế không cạnh tranh MAO-A và B ở ty thể của tế bào
não chuột với giá trị IC50 lần lượt là 4 và 62 µM. Berberin chỉ ức chế cạnh
tranh với giá trị IC50 là 126 µM. Trong khi palmatin không có khả năng ức
chế mặc dù nồng độ dùng là 200 µM [31,39].
Dịch chiết Hoàng liên cho thấy khả năng tăng tiết và tăng hoạt tính của
enzym tyrosin hydroxylase kích thích nơ-ron thần kinh trong mô hình in vitro
chuyển hóa trong cơ thể [7]. Hiện chưa có nghiên cứu chứng minh độc tính
của Hoàng liên chân gà lên cơ thể người.
1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym
Acetylcholinesterase in vitro
1.2.1. Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai
trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
1.2.1.1. Acetylcholin
Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn
các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ.
Acetylcholin tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân
và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần
kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa
ACh.
Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym
cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối
dây thần kinh, trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối
dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và
gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì
sự có mặt của enzym AChE. Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân
tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế
bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE
sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [8,11].
Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức
năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh. Trong đó, ACh được
xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình
sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não
của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [33].
1.2.1.2. Enzym Acetylcholinesterase
AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một
rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE
Footer Page 22 of 116.
14
Header Page 23 of 116.
thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng
bệnh [15,33].
1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc
tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro
Nghiên cứu sàng lọc là giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát
triển thuốc mới. Giai đoạn này thường tiến hành đánh giá hoạt tính của một
lượng lớn các mẫu thử. Vì vậy, những phương pháp được lựa chọn để sử dụng
ở giai đoạn này phải là những phương pháp có thể tiến hành đồng thời nhiều
mẫu, lượng mẫu cần ít, cho kết quả nhanh và chi phí thấp. Phương pháp thử in
vitro đáp ứng được tất cả những yêu cầu đó. Đối với nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là
phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử
muối Fast Blue B.
1.2.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây
dựng và ứng dụng sớm nhất. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng
khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng. Trong đó, phương pháp đo
quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp
này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB).
Phương pháp đo quang
Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym
cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm
chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ
khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung
dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun
dung dịch AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun
trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được
phun sau. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu
trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả.
1.2.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử
dụng phương pháp này để sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn
chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là
muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).
Phương pháp đo quang
Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công
bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [7]. Nguyên tắc của
phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải
phóng chất α-naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast
Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách
đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó, không
có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác
Footer Page 24 of 116.
16
Header Page 25 of 116.
dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di
Giovanni S. [15]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả
Footer Page 25 of 116.
17
Copyright: Tài liệu đại học ©