BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU CeO2 CÓ CẤU TRÚC NANO
NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

Hà Nội - 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU CeO2 CÓ CẤU TRÚC NANO
NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN

Ngành: Khoa học vật liệu
Mã số: 9440122

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. PHƯƠNG ĐÌNH TÂM
2. GS.TS. TRẦN TRUNG

Hà Nội - 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được tác giả khác công bố.

Hà Nội, ngày
TM. Tập thể hướng dẫn

tháng

năm 2020

Tác giả

PGS.TS Phương Đình Tâm

Nguyễn Thị Nguyệt

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ ix
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. x
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chương 1: CẢM BIẾN ADN ĐIỆN HÓA .............................................................. 6
1.1 Giới thiệu về chuỗi ADN .................................................................................. 7

Chương 3: PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN ADN TRÊN CƠ SỞ CÁC THANH
NANO CeO2 ............................................................................................................ 56
3.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 56
3. 2 Thực nghiệm .................................................................................................. 59
3.2.1 Hóa chất .................................................................................................... 59
3.2.2 Cố định ssADN ......................................................................................... 59
3.2.3 Các phép đo điện hóa ................................................................................ 62
3.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 62
3.3.1 Kết quả cố định chuỗi ssADN .................................................................. 62
3.3.2 Đặc trưng của cảm biến ADN .................................................................. 66
3.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm ...................................................... 69
3.3.4 Độ lặp lại, độ ổn định, tính chọn lọc và khả năng tái sử dụng ................. 73
Kết luận chương 3 ................................................................................................. 75
Chương 4: CẢM BIẾN SINH HỌC ADN TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU NANO
COMPOSIT CeO2@Ppy ........................................................................................ 76
4.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 76
4.2 Thí nghiệm ...................................................................................................... 78
4.2.1 Hóa chất .................................................................................................... 78
4.2.2 Cố định các chuỗi ssADN dò lên bề mặt điện cực ................................... 79
4.2.3 Phân tích điện hóa ..................................................................................... 79
4.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 79
4.3.1 Kết quả cố định ssADN ............................................................................ 79
4.3.2 Đặc trưng điện hóa của cảm biến sinh học ADN ..................................... 81
4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thông số đến tín hiệu ra của cảm biến
........................................................................................................................... 84
4.3.4 Độ chọn lọc, độ lặp lại và độ ổn định của cảm biến sinh học ADN ......... 86

iv




APTES

3-Aminopropyl-triethoxy-

3-Aminopropyl-triethoxy-

silane

silan

3

ASV

Adsortive

Stripping Vôn-ampe hòa tan hấp phụ

Voltammetry
4

BSA

Bovine Serum Albumin

Bovine Serum Albumin

5



9

DAO

Diamin Oxidase

Enzym DAO

10

DIG

Digoxigenin

Digoxigenin

11

DPV

Differential

Pulse Quét thế xung vi sai

Voltammetry
12

dsADN



Ethylene Diamine Tetracetic Etylen Diamin Tetracetic A
Acid

16

EIS

X-ray Phổ tán sắc năng lượng tia

xít
Impedance Phổ tổng trở điện hóa

Electrochemical
Spectrocopy

17

18

ELISA

FESEM

Enzym-linked

Xét nghiệm miễn dịch liên

Immunosorbent assay


Gonadotropin
21

HRP

Horseradish peroxide

Horseradish Perô xít

22

IEP

Isoelectric Point

Điểm đẳng điện

23

ISFET

Ion-Sensitive

Field-Effect Trasistor hiệu ứng trường

Transistor

nhạy ion

24


28

NRs

Nanorods

Các thanh nano

29

PABA

Acid Para-Aminobenzoic

A xít 4-Aminobenzoic

30

PANAM

Poly Amidoamine

Poly amidoamin

31

PANi

Polyaniline


Pyrrole

Pyrol

36

RE

Reference electrode

Điện cực so sánh

37

SCE

Saturated Calomel Electrode

Điện cực Calomen bão hòa

38

SMOs

Solid Metal Oxides

ô xít kim loại bán dẫn

39

Phân tích nhiệt

43

TMC

N-trimetyl chitosan

N-trimetyl chitosan

vii


44

WE

Working electrode

Điện cực làm việc

45

XRD

X-ray Diffraction

Nhiễu xạ tia X

viii

Hình 1.12: Sơ đồ cố định và lai hóa ADN lên bề mặt điện cực Au ........................ 18
Hình 1.13: Sơ đồ cố định ssADN dò thông qua tương tác streptavidin – biotin ..... 19
Hình 1.14: Sơ đồ các kiểu liên kết của chất chỉ thị oxy hóa khử tới bề mặt ADN . 22
Hình 1.15: Sơ đồ cảm biến điện hóa ADN dựa trên nhãn enzyme theo Gang Liu . 23
Hình 1.16: Sơ đồ cảm biến ADN dựa trên nhãn hạt nano Fe3O4/TMC/Au ............ 25
Hình 1.17: Sơ đồ sự phát hiện điện hóa ADN không đánh dấu theo R. Nurmalasari
.................................................................................................................................. 26
Hình 1.18: Sơ đồ sự phát hiện điện hóa ADN không dán nhãn .............................. 27
Hình 1.19: Đồ thị quét thế vòng (A) và đồ thị Nyquist (B) của cảm biến ADN ..... 28
Hình 2.1: Quy trình tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 bằng phương pháp thủy
nhiệt .......................................................................................................................... 35
Hình 2.2: Quy trình tổng hợp CeO2@Ppy ............................................................... 36
Hình 2.3: Ảnh FESEM CeO2 NRs phụ thuộc nồng độ chất tạo mầm Na3PO4........ 38
Hình 2.4: Phổ nhiễu xạ tia X của CeO2 khi thay đổi nồng độ các chất tạo mầm .... 39
Hình 2.5: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 khi nồng độ Ce3+ thay đổi .......................... 40
Hình 2.6: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 thủy nhiệt khi nhiệt độ thay đổi ................. 41
Hình 2.7: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 khi thời gian thay đổi ................................. 43
Hình 2.8: Giản đồ nhiễu xạ tia X mẫu CeO2 khi thời gian thủy nhiệt ..................... 44
Hình 2.9: Phổ tán sắc năng lượng tia X của các thanh nano CeO2 ......................... 45
x


Hình 2.10: Cơ chế hình thành CeO2 cấu trúc nano ................................................. 46
Hình 2.11: Cơ chế hình thành thanh nano CeO2 ..................................................... 46
Hình 2.12: Hình ảnh FESEM của mẫu poly pyrol tinh khiết .................................. 47
Hình 2.13: Ảnh FESEM nano composit CeO2- Ppy phụ thuộc tỷ lệ CeO2/Py....... 49
Hình 2.14: Ảnh hưởng của thời gian polyme hóa đến hình thái bề mặt của
nano composit CeO2-Ppy đặc trưng bởi FESEM ..................................................... 50
Hình 2.15: Hình thái cấu trúc của nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy
đặc trưng bởi: (a)- FESEM và (b)– TEM ................................................................. 51

bằng phương pháp PCR với số liệu của cảm biến ADN .......................................... 89

xii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, bệnh dịch do vi sinh vật gây ra đang là mối hiểm hoạ không thể
lường trước được. Trong những năm qua đã có hàng chục nghìn người chết bởi các
loài vi sinh vật gây bệnh như: vi rút H5N1, SARS, vi khuẩn gây bệnh tả, vi rút viêm
não Nhật Bản... gây ra. Trong số đó, căn bệnh thương hàn do chủng vi khuẩn
Salmonella gây ra đã khiến hàng chục triệu người mắc bệnh với số người chết lên
tới hàng triệu người. Theo thống kê của Bộ y tế [1] ở Việt Nam tỷ lệ mắc thương
hàn tính trên 100.000 dân trong năm: 2010 là 64,4; 2011 là 56,8, trong đó tỷ lệ tử
vong là 0,02/100.000 dân; tới năm 2016 là 0,58. Tính riêng cho đối tượng là trẻ em
số ca mắc thương hàn do khuẩn Salmonella theo các năm 2012, 2013, 2014, 2015
và 2016 lần lượt là: 613, 706, 469, 492, 374 với số trẻ chết được ghi nhận vào năm
2014 là 3 trẻ. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện vi sinh vật gây
bệnh đang là yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các nhà khoa học cũng như của các hãng
công nghiệp.
Hiện nay, các phương pháp phân tích nhanh vi sinh vật thường được sử dụng
là PCR, ELISA, nuôi cấy tế bào... là các phương pháp phân tích truyền thống trong
công nghệ sinh học. Trong đó, các xét nghiệm miễn dịch như ELISA chỉ có thể phát
hiện được Salmonella ở giới hạn 104 đến 105 CFU/mL, với thời gian làm giàu mẫu
mất khoảng 16 h đến 24 h và giới hạn này được cải thiện bằng phương pháp phản
ứng chuỗi PCR xuống tới 5 CFU/mL [2]. Việc lấy mẫu xét nghiệm đòi hỏi quy trình
khắt khe, các thí nghiệm phải được thực hiện trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn
của tổ chức Y tế thế giới, trang thiết bị đắt tiền. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển
phương pháp bổ sung cho các phương pháp này là việc hết sức cần thiết. Trong đó,
sử dụng cảm biến sinh học được cho là phương pháp hiệu quả, bổ sung cho các

chân không) khoảng 5,0 eV [11] và CeO2 có giá trị hàm công là 5,34 eV [12] khi
tiếp xúc các electron lẻ của Ppy dễ dàng chuyển sang các orbital trống của Ce với
cấu hình 3d94f0 trong CeO2, tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành các liên kết
cộng hóa trị giữa “Salmonella ssADN dò” và vỏ PPy. Khi đó cấu trúc lõi-vỏ này
đảm bảo được độ xốp, cùng những khoảng trống không gian chứa dung dịch có tác
nhân phân tích để tạo ra cảm biến ADN đối với vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu
chẩy cấp ở người.
“Nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng
trong cảm biến ADN” là đề tài mà nghiên cứu sinh hướng tới. Theo đó việc tập
2


trung nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano (CeO2 NRs)
có kích thước phù hợp và trên bề mặt được che phủ bởi lớp PPy tạo thành cấu trúc
lõi-vỏ với lớp hấp phụ “Salmonella ssADN dò”, tạo thành một cảm biến sinh học
phát hiện khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy ở người.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu chung của đề tài là phát triển cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật
liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy cấp.
Mục tiêu cụ thể:
✓ Tổng hợp được vật liệu nano một chiều CeO2 và vật liệu nano composit
CeO2@Ppy có cấu trúc lõi vỏ.
✓ Phát triển được cảm biến ADN hiệu suất cao trên cơ sở vật liệu nano một
chiều CeO2 chế tạo được.
3. Nội dung nghiên cứu của luận án
- Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2 và vật liệu CeO2@Ppy có cấu trúc
lõi vỏ.
- Nghiên cứu cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm biến.
- Phát triển cảm biến ADN trên cơ sở các vật liệu đã chế tạo được nhằm phát
hiện đoạn ADN của vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp.

trên cơ sở vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano và vật liệu lai giữa CeO2 và
polyme dẫn. Cơ chế phát hiện của cảm biến đã được giải thích rõ ràng trên cơ sở sự
tương tác của chuỗi ssADN dò với ssADN đích.
Cảm biến ADN sau khi được phát triển sẽ góp phần vào sự phát triển phương
pháp phát hiện các vi sinh vật gây bệnh, ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học và môi
trường.
6. Những đóng góp mới của luận án
Những nghiên cứu của luận án đã mang lại những đóng góp mới bao gồm:
- Đã tổng hợp được vật liệu thanh nano CeO2 có chiều dài ~200 nm và đường
kính ~20 nm bằng phương pháp thủy nhiệt đơn giản với tiền chất ban đầu là
Ce(NO3)3.6H2O và chất khoáng hóa Na3PO4, thời gian thủy nhiệt ngắn (24 h)
và nhiệt độ 200 oC.
- Đã chế tạo được vật liệu nano composit có cấu trúc lõi vỏ CeO2/Ppy bằng
phương pháp trùng hợp hóa học với tỷ lệ tiền chất CeO2/Py = 1/10, thời gian
tổng hợp 6 h, trong dung dịch chứa FeCl3.6H2O.
- Đã phát triển được cảm biến ADN điện hóa trên cơ sở vật liệu thanh nano
CeO2 nhằm xác định vi khuẩn Salmonella với giới hạn phát hiện và độ nhạy
tương ứng là 0,01 µM và 3362,1 ΩµM-1cm-2. Khoảng phát hiện tuyến tính từ
0,01 µM đến 2 µM.
4


- Đã phát triển một cảm biến sinh học ADN dựa trên vật liệu nano composit
cấu trúc lõi-vỏ CeO2-NR@Ppy nhằm phát hiện vi khuẩn Salmonella với
khoảng tuyến tính là 0,01÷0,4 nM, độ nhạy 593,7 ΩnM-1cm-2. Giới hạn phát
hiện và giới hạn định lượng của cảm biến ADN tương ứng là 0,084 nM và
0,28 nM.
7. Cấu trúc của luận án
Bản luận án được trình bày theo bố cục như sau:
MỞ ĐẦU

này được phát hiện bằng bộ chuyển đổi. Ngoài ra, nó còn có bộ phận chuyển đổi và
xử lý tín hiệu.
Có nhiều cách để phân loại cảm biến sinh học. Dựa vào các phần tử sinh học,
nó được chia thành cảm biến enzym, cảm biến miễn dịch và cảm biến ADN…v.v.
Nếu dựa vào bộ chuyển đổi tín hiệu, cảm biến sinh học được chia thành cảm biến
quang, cơ, nhiệt, điện. Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở bộ chuyển đổi tín
hiệu điện được sử dụng nhiều hơn cả do nó có cấu tạo đơn giản, thiết bị nhỏ gọn, độ
nhạy cao. Trong các bộ chuyển đổi tín hiệu điện, bộ chuyển đổi tín hiệu điện hoá
đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Đây là bộ chuyển
đổi dựa vào sự tương tác của các phân tử sinh học với các chất cần phân tích làm
thay đổi tín hiệu sinh hoá, tín hiệu này sẽ được phát hiện bằng bộ chuyển đổi và
hiển thị ở đầu ra của cảm biến.
Trong chương này, tác giả sẽ trình bày tổng quan về cảm biến sinh học ADN
điện hoá. Nội dung chương sẽ khái quát lại cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện
6


hóa, các bộ chuyển đổi sử dụng trong cảm biến sinh học ADN, phương pháp cố
định, cơ chế phát hiện lai hóa và các ứng dụng của cảm biến sinh học điện hóa
ADN.

1.1 Giới thiệu về chuỗi ADN
ADN có tên gọi đầy đủ là axit deoxyribo nucleic cấu tạo bởi 2 chuỗi polyme
sinh học là các poly nucleotit liên kết với nhau hình thành cấu trúc xoắn kép xung
quanh một trục tưởng tượng (Hình 1.1-(A)).

Hình 1.1: Hình ảnh mô phỏng phân tử ADN với 2 chuỗi xoắn kép [16]

Mỗi nucleotit được cấu tạo bởi các nucleobazo gọi tắt là bazo chứa nitơ liên
kết với một phân tử đường deoxyribo và một nhóm phốt phát thông qua các liên kết

nhất trên bề mặt điện cực khi có dòng điện đi qua tại điện thế tương ứng là 1,18 và
1,05 V (so với điện cực calomen bão hòa-SCE) [17]. Đây là một trong những tính
chất quan trọng của ADN được các nhà khoa học sử dụng để phát hiện sự lai hóa
các chuỗi ssADN trong cảm biến sinh học ADN điện hóa.
8


1.2 Cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện hóa sử dụng trong
nghiên cứu cảm biến ADN
Các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm biến ADN hoạt
động dựa trên cơ sở bình điện hóa 3 điện cực bao gồm: điện cực làm việc (WE),
điện cực đối hay điện cực tham chiếu (CE), thường sử dụng điện cực Pt hoặc C
graphit, và điện cực so sánh (RE) có điện thế điện cực không đổi, thường dùng là
điện cực Ag/AgCl. Để thực hiện phép đo điện hóa, các điện cực được kết nối với hệ
đo điện hoá có phần mềm điều khiển trên máy tính. Hiện nay, các phương pháp đo
phổ biến thường được sử dụng trong các cảm biến sinh học điện hóa nói chung và
cảm biến sinh học điện hóa ADN nói riêng là: phương pháp quét thế vòng, quét thế
xung vi phân, quét thế sóng vuông và phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa. Đặc
điểm chính của các phương pháp này được khái quát ở các phần tiếp theo sau đây.
1.2.1 Phương pháp quét thế vòng
Quét thế vòng là phương pháp nghiên cứu điện hóa trên cơ sở cho dòng một
chiều đi qua bình điện hóa có điện thế biến đổi theo thời gian với tốc độ quét được
giữa ở một giá trị nhất định. Cường độ dòng trao đổi giữa điện cực WE và CE sẽ
được ghi lại theo sự thay đổi của điện thế áp đặt lên WE so với điện cực RE. Đồ thị
mô tả sự biến thiên của cường độ dòng điện thu được theo quá trình quét thế được
gọi là đồ thị CV (cyclic voltammetry) (Hình 1.3):

Hình 1.3: Đồ thị quét thế vòng

9

(1.2)

Khi sự lai hóa các chuỗi ssADN xảy ra, hình thành nên chuỗi dsADN có cấu
trúc xoắn kép sẽ làm tăng mật độ nhóm PO4- mang điện tích âm trên bề mặt điện
cực. Do lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm PO4- mang điện tích âm và các ion dò oxy
hóa khử (cũng mang điện tích âm) khiến cho các ion này khó tiếp cận với bề mặt
điện cực hơn, phản ứng oxy hóa khử xảy ra khó khăn hơn dẫn tới cường độ dòng
10


oxy hóa và cường độ dòng khử giảm, điện thế oxy hóa và điện thế khử tăng. Sự thay
đổi vị trí cũng như chiều cao các cực đại dòng oxy hóa (Ipa) và dòng khử (Ipc) trên
đồ thị CV (Hình 1.4) là cơ sở để nhận biết quá trình lai hóa các chuỗi ssADN.

Hình 1.4: Đồ thị CV cảm biến ADN trước và sau khi lai hóa các chuỗi ssADN

1.2.2 Phương pháp quét thế xung vi phân (DPV)
Quét thế xung vi phân cũng là một phương pháp nghiên cứu điện hóa trên cơ
sở bình điện hóa 3 điện cực bằng phương pháp quét thế. Nguyên tắc của phương
pháp này là điện cực làm việc được phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên
tuyến tính theo thời gian, cộng thêm một điện áp xoay chiều dưới dạng xung có biên
độ nhỏ không đổi.
Cường độ dòng được ghi lại hai lần ứng với mỗi xung thế, lần 1 là trước lúc
nạp xung (I1) và lần 2 là trước khi ngắt xung (I2). Cường độ dòng thu được I = I2 –
I1 là hàm của điện thế đặt lên điện cực làm việc. Phổ ghi được có dạng cực đại của
cường độ dòng điện phụ thuộc vào điện thế (Hình 1.5). Vị trí của cực đại xác định
bản chất của chất nghiên cứu còn chiều cao cực đại xác định nồng độ chất nghiên
cứu. Sự lai hóa các chuỗi ssADN dẫn đến sự thay đổi (thông thường là giảm) cường
độ dòng cực đại thu được. Nguyên nhân của hiện tượng này được giải thích tương
tự với phương pháp quét thế vòng. Cụ thể là sự lai hóa các chuỗi ssADN tạo thành