Kho¸ luËn tèt nghiÖp
MỞ ĐẦU
Hiện nay, trên thế giới việc chuyển gen vào thực vật đã trở thành kỹ thuật
thông dụng trong cải tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen được chuyển vào
thực vật và có khoảng 400 loại cây trồng chuyển gen đã được kiểm tra ngoài đồng
ruộng. Nhiều sản phẩm chuyển gen đang được tiêu thụ trên thị trường như bông, ngô,
đậu tương có khả năng kháng sâu, kháng chất diệt cỏ, cải dầu có thành phần dầu thay
đổi, cà chua chín chậm v.v…
Ở nước ta, một số phòng thí nghiệm đã và đang áp dụng kỹ thuật chuyển gen
để cải tạo nhiều loại giống cây trồng khác nhau. Trong đó, Phòng Công nghệ Tế bào
Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học là một trong những đơn vị đang tiến hành theo
hướng nghiên cứu này. Cho đến nay, phòng đã tạo ra được một số dòng cây chuyển
gen và đang đưa vào phân tích. Bên cạnh những đánh giá sự biểu hiện của gen
chuyển như chịu hạn, mặn, kháng sâu, kháng bệnh, những phân tích phân tử cũng
được tiến hành. Cho đến nay, kết quả phân tích phân tử cây chuyển gen chỉ dừng lại
bằng sử dụng kỹ thuật PCR. Lai Southern là kỹ thuật quan trọng, có giá trị khẳng
định sự có mặt của gen chuyển. Ngoài ra, với kỹ thuật này mới có thể đánh giá chính
xác số điểm gắn của gen chuyển, thông qua đó có thể phân tích được sự liên quan
giữa mức biểu hiện và kiểu gắn của gen chuyển.
Nhằm đưa quy trình lai Southern vào mục đích đánh giá cây chuyển gen,
chúng tôi sử dụng các dòng bông kháng sâu làm nguyên liệu nghiên cứu và áp dụng
hệ thống phi phóng xạ DIG để kiểm tra phân tích gen CryIA. Bản khoá luận này báo
cáo lại những kết quả nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong
phân tích cây chuyển gen. Đây là tiền đề cho các phân tích phân tử tiếp theo đối với
các cây chuyển gen khác đã và đang được tạo ra.
1
Khoá luận tốt nghiệp
Chơng 1: Tổng quan tài liệu
1.1. Chuyển gen ở thực vật
1.1.1. Chuyển gen ở thực vật và những lợi ích đối với cải tạo giống cây
trồng
công nghiệp chế biến. Những lợi ích này hớng trực tiếp hơn vào ngời tiêu dùng nh:
- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt.
- Khoai tây tăng hàm lợng tinh bột.
- Vacxin ăn đợc ở ngô và khoai tây.
- Những giống ngô trồng đợc trong điều kiện nghèo dinh dỡng.
- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành và cải dầu [7].
1.1.2. Những thành tựu chuyển gen ở thực vật trên thế giới và trong nớc
Trên thế giới, diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha năm
1996 lên 11 triệu ha năm 1997, 27,8 triệu ha năm 1998, 39,9 triệu ha năm 1999
và tới hơn 44 triệu ha năm 2000. Các quốc gia trồng cây chuyển gen gồm có
Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung Quốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây
Ban Nha, Nam Phi, urugoay và Mỹ. Hiện nay, những sản phẩm lơng thực, thực
phẩm do công nghệ sinh học tạo ra đã có mặt trên thị trờng.
Các thành tựu của biến nạp gen ở thực vật tập trung vào một số hớng nh:
- Chịu chất diệt cỏ
Ngời ta dùng gen tổng hợp EPSP chuyển vào cây trồng để chịu đợc
Glyphosphat. Nhiều loài thực vật đã biến nạp và đang đợc thử nghiệm nh củ cải
đờng, đậu tơng, nho. cải hạt dầu, bông, cà chua và thuốc lá.
Cây đậu tơng chuyển gen chịu thuốc diệt cỏ khống chế cỏ dại tốt hơn,
góp phần nâng cao hiệu quả của các trang trại nhờ tối u hoá năng suất và sử
dụng hiệu quả đất trồng trọt, tiết kiệm thời gian cho nông dân. Giống mới này
hoàn toàn giống các giống đậu tơng khác về dinh dỡng, cấu tạo và phơng thức
chế biến thành thực phẩm và thức ăn gia súc. Đợc trồng nhiều ở Achentina, úc,
Braxin, Canada, EU, Nhật bản, Hàn Quốc, Mexico, Nga, Thụy Điển, Mỹ và
uruguay.
Cải dầu chịu thuốc diệt cỏ đợc trồng tại úc, Canada và Mỹ.
3
Khoá luận tốt nghiệp
- Kháng bệnh virus
Ngời ta đang nghiên cứu các gen kháng bệnh virus ở thực vật. Ngoài ra
các nớc phát triển. Giống cà chua này có thời gian lu trên giá bán hàng dài hơn.
Ngoài ra giống chuyển gen có các đặc tính nh:
- Điều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột để làm chủ mức tinh bột trong sản
phẩm.
- Cải thiện chất lợng đạm tích lũy trong hạt.
- Tăng hàm lợng vitamin A trong hạt gạo, [7].
ở nớc ta, một số phòng thí nghiệm lớn đã và đang đi sâu vào công tác cải
thiện giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen. Tại phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, các bớc cơ bản trong giai đoạn chuẩn bị đã
đợc thực hiện. Đó là:
- Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị nh gen CryIA(b),
CryIA(c), gen ức chế tryspin để trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi
khuẩn, gen chịu lạnh, gen protein giàu tryptopha.
- Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ
thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens, trực tiếp bằng súng bắn gen. Đến nay, nhiều dòng lúa
chuyển gen Xa21, CryIA(c), đu đủ chuyển gen chín chậm và kháng
virus đốm vòng đã đợc tạo ra. Các dòng cây chuyển gen này sẽ đợc đa
vào phân tích phân tử
- Chuẩn bị thiết bị để tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ việc
đánh giá theo dõi cây chuyển gen nh PCR, lai Southern, RFLP, AFPD. Nh
vậy, có thể tiến hành chuyển gen và đa kỹ thuật này vào công việc tạo
giống cây trồng ở Việt Nam [1].
1.2. Các kỹ thuật Phân tích phân tử ADN cây chuyển gen
Cùng với các phân tích và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các
cây chuyển gen nh các chỉ tiêu hoá sinh, nông sinh, mức độ kháng sâu bệnh,
chống chịu các điều kiện ngoại cảnh v.v., phân tích gen chuyển ở mức phân tử
cũng đợc tiến hành song song bằng nhiều kỹ thuật khác nhau nh PCR, lai
5
Khoá luận tốt nghiệp
Việc chọn mồi cũng phải tuân thủ một số nguyên tắc sau:
6
Khoá luận tốt nghiệp
-Trình tự của mồi đợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
xuôi và mồi ngợc, và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt
cặp bổ xung giữa các phần khác nhau của một mồi.
-Tm của mồi xuôi và mồi ngợc không cách biệt nhau một cách quá xa.
Công thức nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:
Tm=81,5 + 16,6(log
10
[J
+
] + 0,41(%G+C) - (600/I) - 0,63(% FA)
Trong đó [J
+
] : Nồng độ các cation hoá trị 1
FA : Chất dùng gây biến tính ADN
I : Chiều dài mồi
-Các mồi chọn phải đặc trng cho trình tự ADN cần khuyếch đại không trùng
với các trình tự lặp lại trên gen.
-Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn. Phản ứng PCR sẽ tối u nếu đoạn
trình tự nhỏ hơn 1kb [5], [12].
Trớc đây trong phản ứng PCR ngời ta thờng dùng ADN polymeraza I
tách chiết từ E. coli và ADN polymeraza của Phage T4. Vì đây là enzyme
không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme mới
vào sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân huỷ). Việc phát hiện ra
các ADN polymeraza chịu nhiệt nh Vert ADN polymeraza, Pfu ADN
polymeraza, Taq ADN polymeraza, đã cho phép quá trình nhân bản đợc thực
hiện một cách tự động hoá. Thông dụng nhất là Taq Polymerse đợc tách ra từ vi
khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus sống ở suối nớc nóng 94-100
nucleotit, nếu sự mất cân băng trong thành phần các nucleotit xẩy ra sẽ dẫn tới các
lỗi sao chép của ADN polymeraza.
Nồng độ ion Mg
2+
cũng là nhân tố ảnh hởng mạnh đến phản ứng PCR.
Tuy nhiên không có một quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối u phải đ-
ợc xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm.
Trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vợt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ
nh vậy là vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn. Trong giai đoạn đầu số lợng bản
sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lợng mẫu ban đầu. Sau đó hiệu quả khuyếch đại
giảm do các nguyên nhân sau:
- Hoạt tính của polymeraza giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao
- Sự cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
- Các bản sao vừa đợc tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau
- Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng [5].
1.2.1.3. Các bớc của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm
3 giai đoạn sau:
-Giai đoạn 1: Biến tính ADN ở nhiệt độ từ 94-95
0
C trong thời gian ngắn 30
giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn.
-Giai đoạn 2: Gắn mồi, nhiệt độ đợc hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động từ 40-60
0
C tuỳ thuộc
vào Tm của mồi mà thời gian bắt cặp khác nhau. Đây là giai đoạn quyết định
tính đặc hiệu của phản ứng.
-Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài. Nhiệt độ tăng lên 72
0
thực vật vì nó cho phép tạo ra một lợng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu. PCR có nhiều
ứng dụng vào các mục đích khác nhau, nh việc xác định trình tự của ADN đợc nhân
bản, nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cADN
để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen. phân tích tiến hoá, phân tích sự đa
dạng di truyền ở mức độ ADN trong và giữa các quần thể. Hiền nay PCR đợc xem
là một phơng pháp nhanh và tơng đối đơn giản để phân tích sơ bộ cây chuyển gen
[1].
1.2.2. Kỹ thuật lai Southern và ứng dụng
1.2.2.1. Nguyên lý của lai Southern
Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) nói chung và lai Southern
nói riêng dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò ADN (ARN) với các
phân tử ADN (ARN, protein) đợc lu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh
học đặc trng. Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại
phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp. Nó có thể áp dụng cho mọi loại
đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lu giữ nh màng
nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhng vẫn duy trì đợc khả năng
gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác [1].
Đối với ADN, phơng pháp này đợc Edwind M. Southern xây dựng và thử
nghiệm thành công vào năm 1975. ở đây, quá trình lai phân tử xảy ra khi hai
đoạn mạch đơn ADN bắt cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho
nhau. Các bớc tiến hành trong kỹ thuật này có thể đợc tóm tắt nh sau:
-ADN bộ gen đợc cắt thành những đoạn có kích thớc khác nhau bằng một
hay nhiều enzym giới hạn (RE) và đợc phân tách bằng điện di trên bản gel.
9
Khoá luận tốt nghiệp
-ADN đợc biến tính ngay trên bản gel rồi đợc thấm truyền lên màng lai.
Trong quá trình thấm truyền vị trí các đoạn ADN trên màng lai đợc giữ
nguyên nh trên bản gel.
-ADN cố định trên màng đợc đem lai với mẫu dò ADN có đánh dấu bằng
phóng xạ hoặc hoá học . Sau quá trình lai ngời ta rửa màng lai để loại bỏ các
-9
g) và thấp hơn. Tuy nhiên phơng pháp đánh dấu
phóng xạ đòi hỏi phòng thí nghiệm có những thiết bị kiểm tra và bảo
10
Khoá luận tốt nghiệp
đảm an toàn phóng xạ đồng bộ. Những năm gần đây kỹ thuật phi phóng
xạ (non-radioactive) hay kỹ thuật đánh dấu lạnh (cold labelling) đang
từng bớc thay thế kỹ thuật phóng xạ. Trong đó nổi bật là kỹ thuật phát
quang hoá học kích hoạt (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) và
kỹ thuật sử dụng đánh dấu với digoxigenin (DIG) [1].
1.2.2.2. Hệ thống phi phóng xạ DIG
Hệ thống phi phóng xạ DIG là phơng pháp đánh dấu và phát hiện axít
nucleic rất nhạy và hữu hiệu. Hệ thống này mang nhiều tính u việt nh an toàn,
mẫu dò đánh dấu có độ bền cao và dung dịch lai có thể dùng lại vài lần. So với
phơng pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ, phơng pháp này cũng có thuận lợi
nh độ nhạy cao và phông nền sạch. Nhng lại tránh đợc những bất lợi nh sự rủi ro
trong khi sử dụng chất phóng xạ, chất thải độc hại, thời gian hiện phim lâu, tính
không bền của mẫu dò đã đánh dấu.
Hình 1: Cấu trúc của Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP
Trong hệ thống DIG, mẫu dò là ADN, ARN đợc đánh dấu bằng cách gắn
với digoxigenin (DIG). Đối với mẫu dò là ADN, yếu tố DIG-11-dUTP đợc
dùng để đánh dấu và đợc gắn kết với phân tử ADN thông qua phản ứng PCR
hay lai với các đoạn nucleotit ngẫu nhiên (hình 1).
ở phơng pháp thứ nhất (hình 2a), với DIG-dUTP có trong hỗn hợp phản
ứng PCR, sản phẩm mẫu dò đợc tạo ra rất đặc hiệu và có độ nhạy cao. Chỉ cần
10 pg đối với ADN plasmit hoặc 10 ng đối với ADN genom là đủ để tạo ra mẫu
dò lai Southern. Phơng pháp đánh dấu ADN bằng PCR đặc biệt thuận lợi trong
dò tìm bản gen đơn lẻ trên màng thấm genom hay ARN thông tin hiếm trên
màng thấm Northern.
11
[16].
a b
Hình 2: Các phơng pháp đánh dẫu của DIG: a: Đánh dấu bằng PCR,
b: Đánh dấu bằng các đoạn 6 nucletit ngẫu nhiên và DIG
1.2.2.3. ứng dụng của kỹ thuật lai Southern
Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử rất
quan trọng và đợc sử dụng nhiều trong các phân tích phân tử nh:
12
Khoá luận tốt nghiệp
- Lập bản đồ giới hạn của một gen
- Phát hiện các đa hình độ dài (fragment polymorphism) của cùng một gen
ở các chủng khác hay giữa các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ
giới hạn giữa chúng
- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một
gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn
- Phát hiện sinh vật chuyển gen, đánh giá số lợng bản gen và điểm gắn của
gen chuyển.
Trong bản luận văn này chúng tôi đi sâu vào các chi tiết tiến hành và kết quả
phân tích phân tử các dòng cây bông chuyển gen thông qua kỹ thuật lai
Southern bằng hệ thống DIG [1].
1.3. nghiên cứu cải tạo cây bông ở Việt Nam
1.3.1. Sự phát triển trong sản xuất và nghiên cứu cải tạo các giống bông ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, sản xuất bông ở Việt Nam không ngừng tăng
trởng về diện tích, năng suất và sản lợng. Đặc biệt, trong vụ trồng bông
2001/2002, diện tích đạt xấp xỉ 30.000 ha, cao nhất từ trớc đến nay, tăng hơn
20% so với năm 2000 và gấp 3 lần so với các năm từ 1990 đến 1996. Đồng thời
sản lợng đạt trên 10.000 tấn xơ, gấp 5 lần so với các năm từ 1990 đến 1996.
Có thể khẳng định sự tăng trởng không ngừng về mọi mặt của ngành bông ở
nớc ta trong thời gian qua có sự đóng góp quan trọng của công tác nghiên cứu khoa
học, tạo điều kiện cho sản xuất bông thực sự đem lại hiệu quả kinh tế cao và đủ sức
dân trồng những giống bông này giảm đợc 20-23% chi phí sản xuất so với những
giống bông không phải là cây bông Bt. Sử dụng bông Bt cũng làm giảm lợng
thuốc trừ sâu khoảng 47 kg/ha.
ở Nam Phi, diện tích trồng bông khoảng trên 80.000 ha và hàng năm
bị thiệt hại đáng kể do sâu bệnh gây nên. Từ năm 1997, ngày càng nhiều nông
dân lựa chọn việc trồng bông Bt do lợi ích nh tăng năng suất và giảm lợng thuốc
trừ sâu. Năm 1998-1999, diện tích trồng bông Bt là 200 ha, năm 1999-2000 lên
tới 789 ha và năm 2000-2001 là 1250 ha.
Việc trồng bông Bt ở Achentina cũng đem lại những lợi ích tơng tự
cho những ngời nông dân địa phơng. Trong mùa 1999-2000, lợi nhuận tăng
14
Copyright: Tài liệu đại học ©