TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA NÔNG HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRONG BỆNH CÂY
(Bài giảng)
Biên soạn
TS. Hà Viết Cường
2009
Mô tả môn học
Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu:
1. Sự đa dạng của tác nhân gây bệnh
2. Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây
3. Chẩn đoán tác nhân gây bệnh
4. Phòng chống tác nhân gây bệnh
Các nhóm tác nhân gây bệnh được lựa chọn là nấm/nấm trứng, vi khuẩn và virus. Các kiến thức
trên sẽ được minh họa dựa trên các tác nhân gây bệnh/cây ký chủ quan trọng (hoặc là mô hình
nghiên cứu phổ biến trên thế giới; hoặc có ý nghĩa kinh tế đối với Việt Nam).
Mục tiêu
Sinh viên có khả năng hiểu và vận dụng các kiến thức của môn học trong nghiên cứu bệnh cây
đặc biệt trong chẩn đoán, nghiên cứu đa dạng và phòng chống.
Học phần tiên quyết
• Bệnh cây đại cương (hoặc Bệnh cây Nông nghiệp)
• Công nghệ sinh học thực vật
MỤC LỤC
Giới thiệu CNSH trong bệnh cây............................................................................................7
1.1.Khái niệm về công nghệ sinh học...................................................................................7
1.2.Công nghệ sinh học trong bệnh cây ...............................................................................7
Chương 1. Di truyền quần thể trong bệnh cây.................................................8
1.Sinh học quần thể của tác nhân gây bệnh...........................................................................8
2. Tiến hóa..................................................................................................................................8
2.1. Tiến hóa .........................................................................................................................8

7.3.2Đa dạng kiểu gen....................................................................................................24
7.3.3Ví dụ đo đa dạng gen và đa dạng kiểu gen............................................................25
8.Chọn lọc tự nhiên.................................................................................................................26
8.1.Khái niệm.......................................................................................................................26
8.2.Hai mô hình chọn lọc.....................................................................................................27
9. Tương tác giữa các lực tiến hóa và cấu trúc di truyền của quần thể tác nhân gây
bệnh.............................................................................................................................................27
9.1.Tương tác giữa đột biến và chọn lọc.............................................................................27
9.2.Tương tác giữa tái tổ hợp và chọn lọc...........................................................................28
9.3.Tương tác giữa trôi dạt di truyền, giao lưu kiểu gen và chọn lọc.................................28
9.4.Tương tác giữa chọn lọc và giao lưu kiểu gen..............................................................29
9.4.1Tương tác giữa tái tổ hợp và giao lưu gen.............................................................29
9.5.Ứng dụng di truyền quần thể để đánh giá các nguy cơ do tiến hóa của tác nhân gây
bệnh...........................................................................................................................................31
Chương 2. Lựa chọn vùng gen của tác nhân gây bệnh .................................34
1.Bộ gen của tác nhân gây bệnh............................................................................................34
1.1.Bộ gen viroid.................................................................................................................35
1.2.Bộ gen virus ..................................................................................................................35
1.3.Bộ gen vi khuẩn và phytoplasma..................................................................................36
1.4. Bộ gen nấm ..................................................................................................................36
2.Chọn vùng gen nghiên cứu.................................................................................................37
2.1.Chọn vùng gen virus......................................................................................................37
2.2.DNA ribosome ..............................................................................................................37
2.2.1Cấu trúc và chức năng RNA ribosome...................................................................37
2.2.2Vai trò của rDNA trong phân loại và nghiên cứu đa dạng và chẩn đoán..............38
2.3.Gen mã hóa....................................................................................................................39
2.4.Các chuỗi lặp.................................................................................................................39
2.4.1Các chuỗi lặp liền kề (tandem repetitive sequences).............................................39
2.4.2Các chuỗi lặp phân bố rải rác (Dispersed repetitive sequences)...........................40
2.5.DNA ti thể (mitochondrial DNA).................................................................................40

10. Kỹ thuật CAPS .................................................................................................................52
11. Kỹ thuật SNP ....................................................................................................................52
12.Kỹ thuật rep-PCR..............................................................................................................53
13.Tóm tắt các kỹ thuật..........................................................................................................53
Chương 4. Phân tích kết quả dựa vào số liệu băng điện di...........................55
1.Giới thiệu..............................................................................................................................55
2.Các bước chính trong phân tích đa dạng dựa trên băng điện di...................................56
2.1.Mô tả sự đa dạng............................................................................................................56
2.2.Tính toán mối quan hệ giữa các đơn vị được phân tích ở bước trên............................57
2.3.Biểu diễn mỗi quan hệ...................................................................................................57
3.Lượng hóa mức đa dạng: đo đa dạng trong quần thể.....................................................57
3.1.Dựa trên số lượng biến dị..............................................................................................57
3.1.1Mức đa hình hay tỷ lệ đa hình (Pj).........................................................................57
3.1.2Tỷ lệ các locus đa hình (P).....................................................................................57
3.1.3Số allele trung bình trên locus................................................................................58
3.2.Dựa vào tần số biến dị...................................................................................................58
3.2.1Số lượng allele hiệu quả (Ae).................................................................................58
3.2.2Mức dị hợp tử kỳ vọng trung bình (H = mức đa dạng di truyền Nei (D)..............59
3.3.Ví dụ tính đa dạng di truyền trong quần thể dùng 1 marker đồng trội.........................60
3.4.Ví dụ...............................................................................................................................60
3.4.1Các bước tính (bảng dưới)......................................................................................60
3.5.Ví dụ tính đa dạng di truyền trong quần thể dùng 1 marker trội..................................61
3.5.1Ví dụ........................................................................................................................61
3.5.2Các bước tính (bảng dưới)......................................................................................62
4. Lượng hóa mối quan hệ di truyền: khoảng cách di truyền (nghĩa rộng).....................63
4.1.Đánh giá các mối quan hệ dựa theo khoảng cách hình học..........................................63
4.1.1Các phương pháp phổ biến tính hệ số tương đồng S (similarity) dựa trên biến nhị
thức (0, 1)...............................................................................................................................63
5.Phần mềm.............................................................................................................................64
4

3.2.Tạo microarray bằng spotting........................................................................................82
4.Gán nhãn dò.........................................................................................................................82
4.1.Gán nhãn trực tiếp.........................................................................................................83
4.2.Gán nhãn gián tiếp.........................................................................................................83
4.3.Gãn nhãn dùng dendrimer.............................................................................................83
5.Vật liệu để cố định dò..........................................................................................................83
6.Các phương pháp gắn dò vào lam kính............................................................................84
7.Ứng dụng microarray DNA................................................................................................84
7.1.Nghiên cứu biểu hiện gen “gene expression profiling”................................................84
8.Chẩn đoán và nghiên cứu kiểu gen (genome typing).......................................................85
Chương 7. Công nghệ RNA interference .......................................................86
1.Lịch sử phát hiện ................................................................................................................86
1.1.Hiện tượng đồng ức chế................................................................................................86
1.2.Hiện tượng chế ngự (quelling)......................................................................................86
1.3.Hiện tượng câm gen cảm ứng bởi virus........................................................................86
1.4.RNA Interferrence.........................................................................................................86
2.Small interfering RNA (siRNA) và microRNA (miRNA)...............................................87
2.1.miRNAs - khám phá......................................................................................................87
2.2.miRNAs - định nghĩa.....................................................................................................87
2.3.miRNAs – nguồn gốc....................................................................................................87
5
2.4.miRNAs – sinh tổng hợp...............................................................................................87
2.5.siRNAs - khám phá........................................................................................................88
2.6.siRNAs - định nghĩa......................................................................................................88
2.7.siRNAs – nguồn gốc......................................................................................................88
2.8.siRNAs – sinh tổng hợp.................................................................................................88
3.So sánh miRNA và siRNA...................................................................................................88
3.1.Giống nhau.....................................................................................................................89
3.1.1Khác nhau...............................................................................................................89
4.Công nghệ RNAi trong tạo giống kháng bệnh virus........................................................89

2.1.2Thiết kế mồi chung (degenerate primer)..............................................................102
2.1.3Phần mềm.............................................................................................................103
2.2.Ví dụ mồi chung..........................................................................................................103
Chương 9. Công nghệ huyết thanh học trong chẩn đoán ...........................104
1.Cơ sở của phản ứng huyết thanh học..............................................................................104
2.3.Các khái niệm..............................................................................................................104
2.3.1Kháng nguyên (antigen):......................................................................................104
2.3.2Nhóm quyết định kháng nguyên (epitope)...........................................................104
2.3.3Kháng nguyên của tác nhân gây bệnh cây...........................................................104
2.3.4Kháng thể (antibody) ...........................................................................................105
2.4.Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng.................................................................106
6
3.Sản xuất kháng thể đơn dòng...........................................................................................106
3.1.Các bước chính để sản xuất kháng thể đơn dòng gồm...............................................106
3.2.Qui trình tạo kháng thể đơn dòng................................................................................107
3.2.1Gây miễn dịch trên thỏ.........................................................................................107
3.2.2Dung hợp (lai).......................................................................................................108
3.2.3Sản xuất.................................................................................................................109
4.Kỹ thuật chẩn đoán bằng ELISA....................................................................................109
4.1.Vật liệu chính cho ELISA...........................................................................................109
4.2.Các kỹ thuật ELISA.....................................................................................................109
4.2.1Kỹ thuật ELISA trực tiếp kiểu kẹp kép kháng thể (DAS-ELISA)......................110
4.2.2Phản ứng ELISA gián tiếp kiểu bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA)...........110
Giới thiệu CNSH trong bệnh cây
1.1. Khái niệm về công nghệ sinh học
Có rất nhiều định nghĩa về công nghệ sinh học (biotechnology) nhưng nhìn chung CNSH có thể
được hiểu theo 2 nghĩa. Theo nghĩa rộng, điển hình như định nghĩa trong Công ước về Đa dạng
Sinh học của Liên hiệp quốc (1992) thì CNSH là “Bất kỳ ứng dụng công nghệ sử dụng các hệ
thống sinh học, các sinh vật sống hoặc các thành phần của chúng nhằm tạo ra hoặc biến đổi các
sản phẩm hoặc qui trình cho một mục đích đặc biệt” “any technological application that uses

bệnh có thể đươc tạo ra dùng 2 chiến lược chính: (i) dùng gen kháng có nguồn gốc từ cây. Đây
là chiến lược áp dụng cho mọi đối tượng dịch hại. (ii) dùng gen từ tác nhân gây bệnh để tạo tính
kháng (tính kháng có nguồn gốc từ bệnh). Đây là chiến lược áp dụng cho các bệnh virus. Vai
trò của CNSH thể hiện ở các kỹ thuật phân lập gen kháng, thiết kế các cấu trúc chuyển gen,
chuyển gen, lai tạo với sự trợ giúp của các marker phân tử. Sử dụng VSV đối kháng hoặc các
sản phẩm có nguồn gốc VSV để phòng chống bệnh cũng có thể được xem là ứng dụng CNSH
(theo nghĩa rộng) trong bệnh cây.
Chương 1. Di truyền quần thể trong bệnh cây
Mục tiêu của chương này là cung cấp các khái niệm cơ bản trong di truyền quần thể. Các khái
niệm này sẽ rất cần thiết giúp sinh viên có khả năng phân tích kết quả sau khi thực hiện các thí
nghiệm dựa trên công cụ CNSH khi đánh giá đa dạng của tác nhân gây bệnh cây.
1. Sinh học quần thể của tác nhân gây bệnh
Sinh học quần thể nghiên cứu các quá trình sinh học ảnh hưởng tới quần thể sinh vật.
Sinh học quần thể, do vậy, cũng là một lĩnh vực nghiên cứu của bệnh cây học vì bệnh cây chỉ
hình thành dưới tác động của 1 quần thể tác nhân gây bệnh. Một vết bệnh trên lá sẽ không có ý
nghĩa về mặt kinh tế lẫn sinh thái. Một vụ dịch gây thiệt hại kinh tế lớn thường do vô số các sự
kiện xâm nhiễm gây bệnh liên quan đến toàn thể quần thể ký sinh và ký chủ. Để phòng chống
bệnh, người ta phải xây dựng các biện pháp phòng chống nhằm vào toàn bộ quần thể tác nhân
gây bệnh. Như vậy, hiểu được sinh học quần thể tác nhân gây bệnh là bước quan trọng nhằm
phát triển các chiến lược phòng chống bệnh hiệu quả.
Một quần thể là một tập hợp các cá thể cùng loài chiếm một không gian địa lý nhất
định và thể hiện sự liên tục về mặt sinh sản từ thế hệ này sang thế hệ khác. Mối tương tác sinh
thái và sinh sản của các cá thể trong cùng quần thể, do vậy, phổ biến hơn so với mối tương tác
của các cá thể thuộc các quần thể khác nhau.
Di truyền quần thể tập trung vào quá trình dẫn tới trao đổi di truyền hay tiến hóa trong
quần thể theo thời gian và không gian. Phần lớn các nghiên cứu di truyền quần thể dựa trên qui
mô thời gian dài (ví dụ qua nhiều mùa vụ hoặc qua nhiều thế hệ tác nhân gây bệnh) và không
gian lớn (ví dụ qui mô toàn cầu cho các đối tượng bệnh có thể phát tán xa). Di truyền quần thể
giải quyết chủ yếu các các quá trình di truyền như đột biến, trôi dạt di truyền, giao lưu gen, hệ
thống sinh sản/ghép cặp và chọn lọc tự nhiên.

nhau hoặc tại các vùng địa lý lân cận. Sự biệt hóa loài có thể xuất hiện nhanh hơn đối với tác
nhân gây bệnh cây so với các sinh vật khác do hậu quả của sự đồng tiến hóa.
Phả hệ học và di truyền quần thể sử dụng các các công cụ phân tích di truy