ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

an

dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

KHOA Y DƯỢC

ed
ic

ine

ĐẶNG THỊ QUỲNH

ht

@

Sc

ho
ol

rm

ĐẶNG THỊ QUỲNH

VN
U

KHOA Y DƯỢC

M

ed
ic

ine

an

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN
CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT., HỌ
GANODERMATACEAE THU HÁI TẠI TÂY NGUYÊN

Sc

ho
ol

of



Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

LỜI CẢM ƠN
Đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen
từ phân đoạn diclomethan của Nấm cổ cò - Ganoderma flexipes Pat., họ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Các phương pháp sắc ký

1

H-NMR

13

Sắc ký cột thường
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ac
y,

Column Chromatography
High Performance Liquid
Chromatography
TLC
Thin Layer Chromatography
Các phương pháp phổ

Sắc ký bản mỏng

dP
ha
rm

CC
HPLC

HMBC

M

HSQC

Phổ DEPT

Phổ khối ion hóa phun mù
điện tử
Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết
Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết
Phổ khối
Phổ tử ngoại

of

MS
UV-Vis

Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân carbon 13

Sc

Diclomethan

Các ký hiệu sinh học
AChE
AD
AIDS

Acetylcholinesterase
Alzheimer
Acquired Immuno Deficiency
Syndrom

Hội chứng mất trí nhớ
Hội chứng suy giảm miễn
dịch mắc phải


Enzyme Catalase
Deoxyribonucleic acid
Effective dose 50%

m/z
Mp
STT
TLTK
v/v
VKH&CNVN

Khối lượng/điện tích
Melting Point
Điểm nóng chảy
Số thứ tự

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

Liều có hiệu quả ở 50%
động vật thí nghiệm
ERK
Extracellular signal - regulated Kinase điều hòa tín hiệu
kinases
ngoại bào
FGFR
Fibroblast growth factor
Yếu tố tăng trưởng nguyên
receptor
bào sợi
GPx
Enzyme Glutathione Peroxidase
HBV
Hepatitis B virus
HIV


Bảng 1.1.

Một số triterpen nhóm I phân lập được từ
chi Ganoderma

6

Bảng 1.2.

Một số triterpen nhóm II phân lập được từ
chi Ganoderma

Bảng 1.3.

Một số triterpen nhóm III phân lập được từ
chi Ganoderma

8

Bảng 1.4.

Một số sterol phân lập từ chi Ganoderma

9
17

Dữ liệu phổ của 2 hợp chất NCC03 và NCC06

31


dP
ha
rm

Bảng 1.5.
Bảng 3.

VN
U

Bảng


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

Trang

VN
U

Hình

Hình 1.1. Cấu trúc của Triterpen nhóm I

6

Hình 1.3. Cấu trúc của Triterpen nhóm III



Hình 3.4. Kết quả chạy HPLC kiểm tra độ tinh khiết của 2
hợp chất NCC03 và NCC06

28

Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03

30

Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06

31

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed

rm

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1.

Tổng quan về chi Ganoderma .............................................................. 3

1.1.1. Vài nét về thực vật của chi Ganoderma. ........................................... 3

an

1.1.2. Thành phần hóa học .......................................................................... 4

ine

1.1.2.1.Triterpen/ Triterpenoid ................................................................... 4
1.1.2.2.Sterol .............................................................................................. 9

ed
ic

1.1.2.3.Polysaccharit .................................................................................. 9
1.1.3. Tác dụng sinh học............................................................................ 10

M

1.1.3.1.Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư.................................. 10

of


py

rig

2.1.

2.2.1. Hóa chất, dung môi ......................................................................... 19
2.2.2. Thiết bị............................................................................................. 19


VN
U

2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh
khiết. ............................................................................................................ 20
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập ............................................... 20
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc ................................. 21

ac
y,

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 24

dP
ha
rm

3.1. Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao phân
đoạn diclomethan. ......................................................................................... 24


ho
ol

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
Kết luận............................................................................................... 35

2.

Kiến nghị ............................................................................................ 35

Sc

1.

@

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Co

py

rig

ht

PHỤ LỤC




py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

Theo cuốn Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam của Nhà
xuất bản Khoa học và kỹ thuật, nước ta có khoảng trên 80 loài nấm Linh chi,
chiếm khoảng 1/3 số loài trên thế giới với không ít loài mới, đặc hữu [7]. Riêng
ở Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc khu vực Tây Nguyên, chi Ganoderma có
ít nhất là 25 loài, trong đó 10 loài có tác dụng dược liệu như Ganoderma
tornatum, Ganoderma amboinense, Ganoderma gibbosum, Ganoderma
capense, Ganoderma lobatum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum,
Ganoderma flexipes, Ganoderma tropicum, Ganoderma cochlear, các loài còn
lại chưa biết rõ ý nghĩa [6]. Do đó, nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở Việt

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dicloromethan.
2. Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân
đoạn.

2



số các loài xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 12 trong năm [6].
Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst.

ed
ic

Theo hệ thống phân loại của P. Karsten (1881) chi Garnoderma Karst.
thuộc:

M

Giới nấm (Fungi).

Ngành nấm đảm (Basidiomycota).

of

Lớp nấm đảm (Agaricomycetes).

ho
ol

Bộ nấm đa tầng (Polyporales).
Họ nấm Lim (Ganodermataceae).

Sc

Chi Ganoderma Karst. [3]

Đặc điểm của chi Ganoderma Karst:

ac
y,

VN
U

Ngoài gần 90% là nước trong đặc trưng của tất cả các loại nấm, 10%
khối lượng còn lại của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm: protein (10 - 40%),
carbohydrate (3 - 28%), chất béo (2 - 28%), chất xơ (3 - 32%), vitamin và
khoáng chất. Người ta đã xác nhận rằng protein có nguồn gốc từ nấm có chứa
tất cả các axit amin thiết yếu và chúng đặc biệt giàu lysine và leucine. Tuy
nhiên, nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong các loại nấm khác nhau của
chi Ganoderma là triterpen và polysaccharit (Boh và cộng sự, 2007) [35].
Triterpen/ Triterpenoid

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol


lập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi. Các triterpen tồn
tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số
nhóm chức như: -OH; -OAc; -O- (eter); C=O; nối đôi C=C. Cấu trúc hóa học
của nó rất phức tạp và bị oxy hóa cao. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan
4


VN
U

tốt trong eter dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether, cloroform), ít tan trong nước
ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [2].

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of


m
r
a

h
P
d

n
a
e

n
i
ic

Hình 1.1. Cấu trúc của Triterpen nhóm I [1]
Bảng 1.1. Một số triterpen nhóm I phân lập được từ chi Ganoderma

6

STT

Triterpen

R1

R2

1

ed

R5

R6

R7

R8

Nguồn gốc

TLTK

H

Δ 24-25

Me

CHO

G. lucidum

[40]

H

Δ 24-25


y
p
Co

h
g
ri

4

t@

Ganorbiformin G

βαβOAc OAc OAc
O

H

OAc

H

H

Δ 24-25


U
N


Triterpen

1

Acid lucidenic A

2

Acid lucidenic C

3
4

R2

R3

R4

O

β-OH

H

Me

β-OH


β-OH

COOH

G. sinense

@
t
h

p
o
C

l
o
o

h
c
S

Methyl lucidenat F

O

O

20-hydroxylucidenic acid A


a

m
r
a

h
P
d

n
a
e

8

n
i
ic

Hình 1.3. Cấu trúc của Triterpen nhóm III [1]

ed

Bảng 1.3. Một số triterpen nhóm III phân lập được từ chi Ganoderma
STT
1
2

Triterpen

R2

ho
O

R5

R6

R7

R8

R9

R10

βOAc

β-OH

α-Me

O

H

COOH

Me


H

H

α-OAc α-Me

H

Δ24-25

Me

COOH

4

Acid ganoderic W

α-OAc

α-OH

H

H

α-OAc α-Me

H


Gần đây, Fa – Huan Ge và cộng sự (2017) lần đầu tiên phân lập được từ
dầu bào tử nấm Linh chi thu được bằng chiết xuất CO2 siêu tới hạn một sterol,
Ganoderin A, được chứng minh là cấu trúc trước đây chưa từng có [19].

ac
y,

Dưới đây là một số sterol đã được phân lập và xác định từ chi
Ganoderma.

dP
ha
rm

Bảng 1.4. Một số sterol phân lập dược từ chi Ganoderma
Sterol

Nguồn gốc

TLTK

1

Ergosterol

G.lucidum

[20, 19]


STT

[43]

M

ed
ic

ine

G.annulare

Polysaccharit

of

1.1.2.3.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ac
y,

Từ thời xa xưa, trong các tài liệu y học cổ đã ghi nhận nhiều tác dụng
bảo vệ sức khỏe của nấm Linh chi đối với cơ thể. Ngày nay, khi nền khoa học
hiện đại ngày càng phát triển, đặc biệt là lĩnh vực phân tử học và dược lý dược
lâm sàng, hàng trăm những công trình nghiên cứu đã công bố, một lần nữa
khẳng định tính năng, công dụng của loài thảo dược quý này. Kết quả của các
nghiên cứu khoa học này cho rằng tác dụng sinh học của chi Ganoderma chủ
yếu do triterpen và polysaccharit đem lại.
Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư

an

1.1.3.1.

ed
ic

ine

Tác dụng chống ung thư của các loài nấm Linh chi đã và đang được quan
tâm, nghiên cứu và ứng dụng nhiều. Nhiều cơ sở khoa học về tác dụng này của
nó đã được công bố.

Sc

ho
ol


Su và cộng sự (2000) đã kiểm tra hoạt động gây độc tế bào của lanostan
từ G. tsugae và tìm thấy hoạt động chống lại ba dòng tế bào ung thư. Lanostan
và một steroid từ G. tsugae đã gây chết tế bào do apoptosis và cho rằng đó là
10


ac
y,

VN
U

sterol sở hữu hoạt động ức chế chu kỳ tế bào (Gan và cộng sự, 1998a). Gonzalez
và cộng sự (2002) cũng đã quan sát thấy apoptosis trong các tế bào ung thư
bạch cầu ở người tiếp xúc với ba lanostanoid phân lập từ G.concinna. Ngược
lại, ba triterpen từ G. concinna đã ức chế DNA polymerase của bê và chuột có
liên quan đến sửa chữa DNA, tái tổ hợp và sao chép DNA (Mizushina và cộng
sự, 1999) [38].

dP
ha
rm

Triterpen được coi là tác nhân chống ung thư tiềm năng do hoạt động
chống lại các khối u đang phát triển (Lin và cộng sự, 2003): chúng gây độc tế
bào trực tiếp chống lại các tế bào khối u (Gonzalez và cộng sự, 2002) [38].

ed
ic


dịch, được trung gian bởi các polysaccharit, có thể là cơ chế chính giải thích
cho khả năng chống khối u của nấm Linh chi. Trong số rất nhiều polysaccharit,
β- D -glucan chịu trách nhiệm chính cho các hiệu ứng chống độc [48].

Co

py

rig

ht

Isocitrate dehydrogenase (IDH) là một trong những enzyme quan trọng
trong chu trình acid tricarboxylic, và đột biến IDH có liên quan đến nhiều bệnh
ung thư. Bằng phương pháp sàng lọc phối tử ảo, phát hiện rằng sterol có tiềm
năng ức chế IDH1. Như vậy, phát hiện của Zheng M và cộng sự nhấn mạnh
rằng hợp chất sterol từ Ganoderma sinense có thể có tiềm năng lâm sàng trong
các liệu pháp khối u như một chất ức chế hiệu quả của IDH1 đột biến [51].
11


dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

Ganoderma thì terpen được chứng minh là phần có hoạt tính chống oxy hóa
cao nhất [15]. Sự gia tăng các enzym chống oxy hóa chủ yếu được đóng góp
bởi axit ganoderic. Nó có thể kích hoạt yếu tố hạt nhân erythroid 2 liên quan
đến yếu tố 2 (Nrf2), từ đó khởi đầu sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa
(SOD, CAT và GPx) và do đó tăng cường nồng độ enzyme chống oxy hóa (Ko
và cộng sự 2008) [29].

ht

@

Sc

ho
ol

Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, Chu cùng cộng sự (2012)
suy ra rằng do sự hiện diện của lanostan triterpen có thể góp phần vào việc hạ
lipid máu. Kết quả đánh dấu gan và siêu âm bụng cho thấy lanostan triterpen
có thể cải thiện chức năng gan (bảo vệ gan) bằng cách giảm căng thẳng oxy
hóa (ROS), lắng đọng lipid và do đó làm giảm tổn thương gan cũng như bình
thường hóa các tình trạng bất thường khác nhau như gan nhiễm mỡ và polyp
túi mật [14].

py

rig

Các nghiên cứu này đã chứng minh tính chống oxy hóa, chống lão hóa
và bảo vệ gan của triterpen bằng cách kiềm chế stress oxy hóa một cách hiệu


an

Năm 2011 Kao cùng các cộng sự báo cáo rằng β-1,3-glucan (một glucan
trọng lượng phân tử thấp) được phân lập từ G. lucidum có thể tăng đáng kể
(40% - 80%) khả năng sống sót của dòng tế bào đại thực bào bạch cầu đơn nhân
chuột (RAW 264,7) với stress oxy hóa do H2O2 gây ra, và giảm sự hình thành
các loại gốc tự do oxy hóa (ROS) [27].
Tác dụng kháng virut

ed
ic

1.1.3.3.

@

Sc

ho
ol

of

M

HIV là virut gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS).
Phương pháp điều trị hiện tại cho HIV là hoãn sự phát triển của AIDS. Một số
triterpen của các loài nấm Linh chi (ganoderic acid beta, lucidumol B,
ganodermanondiol, ganodermanontriol và ganolucidic acid A) đã được chứng

VN
U

so với kháng sinh ampicillin và streptomycin, trong khi Staphylococcus aureus
và Bacillus cereus là những vi khuẩn nhạy cảm nhất. Nồng độ ức chế tối thiểu
nằm trong khoảng 0,0125-0,75 mg/mL và nồng độ diệt khuẩn là 0,035-1,5
mg/mL [22]. Như vây, polysaccharit cho thấy hoạt động kháng khuẩn, ức chế
sự phát triển của vi khuẩn hoặc gây ra cái chết của vi khuẩn gây bệnh. Tuy
nhiên, các cơ chế hoạt động chống vi khuẩn của nấm Linh chi vẫn chưa được
xác định rõ ràng [15].

dP
ha
rm

Các hợp chất sterol của G.applanatum, được tìm thấy có hoạt tính phổ
kháng khuẩn rộng và tác dụng diệt khuẩn [15]. Ganomycins A và B từ
G.pfeifferi thể hiện hoạt động chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương
[34].

an

Ngoài ra, Wang và cộng sự đã phân lập được protein kháng nấm 15 kDa,
được xác định là ganodermin, từ G.lucidum [45].
Tác dụng trên hệ thần kinh

ine

1.1.3.5.


tác giả cho thấy polysaccharit có thể phục vụ như một tác nhân trị liệu tái tạo
để điều trị suy giảm nhận thức liên quan đến các bệnh thoái hóa thần kinh [23].

Co

py

Ngoài ra, từ thời cổ đại, G.lucidum được sử dụng như một thuốc giảm
đau và có đặc tính thư giãn [15], Matsuzaki và cộng sự cũng đã báo cáo rằng
chiết xuất nước giàu polysaccharit thể hiện tác dụng chống trầm cảm và giảm
hành vi lo lắng ở chuột [33].
14


1.1.3.6.

Tác dụng khác

VN
U

Sterol phân lập từ nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng ức
chế tổng hợp cholesterol trong ống nghiệm [28].

dP
ha
rm

ac
y,


rig

ht

@

Sc

ho
ol

Nấm Cổ cò có tên khoa học là Ganoderma flexipes Pat., được cho là có
nguồn gốc từ Việt Nam. Bằng chứng đã được trình bày trong các nghiên cứu
phát sinh gen trước đây rằng đây là một loài độc lập (Cao và cộng sự, 2012;
Wang và cộng sự, 2012), được tìm thấy rộng rãi trên khắp châu Á cận nhiệt đới
và nhiệt đới. Cao và cộng sự (2012) đề xuất rằng Ganoderma atrum,
Ganoderma calidophilum, Ganoderma hhaiense (J.D. Zhao và cộng sự, 1979)
và Ganoderma parviungulatum (J.D. Zhao & X.Q. Zhang, 1986) tất cả được
mô tả từ tỉnh Hải Nam, Trung Quốc của Giáo sư Ji-Ding Zhao và các đồng
nghiệp của ông là từ đồng nghĩa của G.flexipes [52].

Co

py

Vị trí phân loại của Ganoderma flexipes Pat.
Giới

: Mycota hay Fungi

: Hymenomycetidae
Bộ
: Ganodermatales
Họ
: Ganodermataceae
Chi
: Ganoderma
Đặc điểm sinh học của Ganoderma flexipes Pat.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

Hình 1.4. Nấm Cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây Nguyên
a. Quả thể b. Bào tử c. Bào tầng
Ghi chú: Thước đo tự nhiên = 2cm, thước đo hiển vi 2µm,
thước đo bào tầng = 0.5 mm