ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG THỊ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP
CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN
DICLOROMETHAN CỦA NẤM CỔ CÒ
- GANODERMA FLEXIPES PAT.,
HỌ GANODERMATACEAE THU HÁI
TẠI TÂY NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG THỊ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN

CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT., HỌ
GANODERMATACEAE THU HÁI TẠI TÂY NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua.
Dù đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ từ nhiều nguồn nhưng vì
kiến thức cũng như thời gian còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh
khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến
đóng góp của quý thầy cô, bạn bè để khóa luận của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Đặng Thị Quỳnh


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Các phương pháp sắc ký
CC
HPLC
TLC
Các phương pháp phổ
1

H-NMR

13

C-NMR

DEPT
ESI-MS
HMBC
HSQC
MS

Các ký hiệu viết tắt khác
m/z
Mp
STT
TLTK
v/v
VKH&CNVN


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Bảng 1.1.
Bảng 1.2.
Bảng 1.3.
Bảng 1.4.
Bảng 1.5.
Bảng 3.


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Hình 1.1.
Hình 1.2.
Hình 1.3.
Hình 1.4.
Hình 2.
Hình 3.1.
Hình 3.2.
Hình 3.3.
Hình 3.4.


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................19
2.1.

Đối tượng nghiên cứu.................................................................................................. 19

2.2.

Hóa chất, thiết bị............................................................................................................. 19

2.2.1. Hóa chất, dung môi................................................................................................... 19
2.2.2. Thiết bị............................................................................................................................. 19


2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh
khiết.................................................................................................................................................... 20
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập................................................................ 20
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc............................................. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................................................... 24
3.1. Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao phân
đoạn diclomethan......................................................................................................................... 24
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò................................................................ 24
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn
diclomethan của nấm Cổ cò................................................................................................ 26
3.1.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết............................................................................. 27
3.2.

Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06......................................... 28

3.2.1. Hợp chất NCC03........................................................................................................ 28

cường hệ miễn dịch, giải độc gan, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giảm cholesterol
trong máu… Chính vì thế, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong phòng ngừa và
điều trị bệnh là rất lớn, không chỉ ở Việt Nam, mà còn ở nhiều nơi trên thế giới
như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,…[9].
Theo cuốn Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam của Nhà
xuất bản Khoa học và kỹ thuật, nước ta có khoảng trên 80 loài nấm Linh chi,
chiếm khoảng 1/3 số loài trên thế giới với không ít loài mới, đặc hữu [7]. Riêng
ở

Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc khu vực Tây Nguyên, chi Ganoderma có ít

nhất là 25 loài, trong đó 10 loài có tác dụng dược liệu như Ganoderma tornatum,
Ganoderma

amboinense,

Ganoderma

lobatum,

Ganoderma

Ganoderma

gibbosum,

Ganoderma

capense,



2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về chi Ganoderma

1.1.1. Vài nét về thực vật của chi Ganoderma.
Chi Ganoderma thuộc họ Ganodermataceae Donk, trong tất cả, có 219
loài trong họ đã được gán cho chi này [13], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới
châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ [5]. Ở Việt Nam, theo GS.TSKH Trịnh
Tam Kiệt, có khoảng 80 loài, phân bố rộng, đặc biệt vùng nhiệt đới [3]. Riêng
trong hệ sinh thái của vườn Quốc gia Kon Ka Kinh ở Tây Nguyên nước ta đã
định danh được 25 loài nấm thuộc chi này [6]. Các loài nấm thuộc chi
Ganoderma đa số sinh trưởng và phát triển dưới tán rừng ở sinh cảnh rừng lá
rộng thường xanh là chủ yếu, tiếp theo là một số sinh cảnh khác như rừng lá
rộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng lá kim, rừng hỗ giao tre nứa. Đa
số các loài xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 12 trong năm [6].
Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst.
Theo hệ thống phân loại của P. Karsten (1881) chi Garnoderma Karst.
thuộc:
Giới nấm (Fungi).
Ngành nấm đảm (Basidiomycota).
Lớp nấm đảm ( Agaricomycetes).
Bộ nấm đa tầng (Polyporales).
Họ nấm Lim (Ganodermataceae).
Chi Ganoderma Karst. [3]
Đặc điểm của chi Ganoderma Karst:

Hàng trăm hợp chất triterpen đã được phân lập từ chiết xuất methanol,
ethanol, acetone và chloroform của bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của các
loại nấm Linh chi, đặc biệt là loài G.lucidum [36].
Kubota lần đầu tiên phân lập được axit ganoderic A và axit ganoderic B
từ Ganoderma lucidum (FR.) KARST năm 1982. Kể từ đó, hơn 316 triterpen
đã được phân lập từ cơ thể đậu quả, bào tử, và sợi nấm của nhiều loại nấm
Linh chi trong chi Ganoderma [46].
Cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên lanostane, là một chất chuyển
hóa của lanosterol, thông thường chúng có hai nhóm cụ thể được xác định là
ganoderic (C30) và axit lucidenic (C27). Theo nghiên cứu của Cole R. J. và
Schweikert M. A. đã có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol (acid
ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, acid lucidenic,...) được phân
lập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi. Các triterpen tồn
tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số
nhóm chức như: -OH; -OAc; -O- (eter); C=O; nối đôi C=C. Cấu trúc hóa học
của nó rất phức tạp và bị oxy hóa cao. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan
4


tốt trong eter dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether, cloroform), ít tan trong nước
ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [2].
Các triterpen phân lập từ chi Ganoderma được phân thành từng nhóm
khác nhau theo 3 cấu trúc chính dưới đây.

5


6

Bảng 1.1. Một số triterpen nhóm I phân lập

1

Acid lucide

2

Acid lucide

3

Acid 20 -hydroxy

4

Methyl lucid

5

20-hydroxylucid


8

STT
1

2

3


5

1.1.2.3.

Polysaccharit

Polysacchrit của linh chi là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng
và phức tạp [10]. Cho đến nay, hơn 200 polysaccharit đã được phân lập từ bào
tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của chi Ganoderma (Huie và Di, 2004). Nhưng
polysaccharit chỉ gồm 2 loại chính và tỉ lệ các thành phần có trong mỗi loại như
sau: GL – A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Glactan, còn GL – B có thành
phần chính là Glu, nên gọi là Glucan [35]. Theo các báo cáo trước đây, các
polysacharit của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm glucan, galactan và/hoặc các
heteropolysaccharit khác bao gồm một số monosaccharit như glucose, galactose,
mannose và fucose [50]. Hầu hết các GPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharit,
có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này
tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000
-

1.000.000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần
9


polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước
nóng [2].
1.1.3. Tác dụng sinh học
Từ thời xa xưa, trong các tài liệu y học cổ đã ghi nhận nhiều tác dụng
bảo vệ sức khỏe của nấm Linh chi đối với cơ thể. Ngày nay, khi nền khoa học
hiện đại ngày càng phát triển, đặc biệt là lĩnh vực phân tử học và dược lý
dược lâm sàng, hàng trăm những công trình nghiên cứu đã công bố, một lần

sterol sở hữu hoạt động ức chế chu kỳ tế bào (Gan và cộng sự, 1998a).
Gonzalez và cộng sự (2002) cũng đã quan sát thấy apoptosis trong các tế bào
ung thư bạch cầu ở người tiếp xúc với ba lanostanoid phân lập từ G.concinna.
Ngược lại, ba triterpen từ G. concinna đã ức chế DNA polymerase của bê và
chuột có liên quan đến sửa chữa DNA, tái tổ hợp và sao chép DNA
(Mizushina và cộng sự, 1999) [38].
Triterpen được coi là tác nhân chống ung thư tiềm năng do hoạt động
chống lại các khối u đang phát triển (Lin và cộng sự, 2003): chúng gây độc tế
bào trực tiếp chống lại các tế bào khối u (Gonzalez và cộng sự, 2002) [38].
Polysacharit phân lập từ chi Ganoderma làm tăng phản ứng miễn dịch
chống khối u bằng cách thúc đẩy hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên và tế bào
lympho T gây độc tế bào [37]. Ngoài ra, các nó cũng được công nhận để cải
thiện sự biểu hiện của phức hợp tương hợp mô, chủ yếu trong dòng tế bào u ác
tính, giúp cải thiện quá trình trình diện kháng nguyên và do đó kích thích kháng
virut và ung thư [44]. Polysaccharit thường không tác động trực tiếp gây đến độc
tế bào trong các tế bào khối u, nhưng tác động đến các hoạt động chống khối u
thông qua việc tăng cường miễn dịch qua trung gian của vật chủ [15].

Theo các nghiên cứu mới nhất của Wiater và cộng sự, các α- D -glucan
được phân lập từ G. lucidum thể hiện hành động gây độc tế bào liên quan đến
các tế bào ung thư HeLa biểu mô ở người [42].
Một số nghiên cứu in vivo đã chứng minh rằng polysaccharit (β- D glucan, heteropolysaccharit và glycoprotein) được phân lập từ Ganoderma có
hoạt tính chống khối u sarcoma 180 ở chuột. Sự kích thích của hệ thống miễn
dịch, được trung gian bởi các polysaccharit, có thể là cơ chế chính giải thích cho
khả năng chống khối u của nấm Linh chi. Trong số rất nhiều polysaccharit, β- D
-glucan chịu trách nhiệm chính cho các hiệu ứng chống độc [48].
Isocitrate dehydrogenase (IDH) là một trong những enzyme quan trọng
trong chu trình acid tricarboxylic, và đột biến IDH có liên quan đến nhiều bệnh
ung thư. Bằng phương pháp sàng lọc phối tử ảo, phát hiện rằng sterol có tiềm
năng ức chế IDH1. Như vậy, phát hiện của Zheng M và cộng sự nhấn mạnh rằng

lipid máu. Kết quả đánh dấu gan và siêu âm bụng cho thấy lanostan triterpen
có thể cải thiện chức năng gan (bảo vệ gan) bằng cách giảm căng thẳng oxy
hóa (ROS), lắng đọng lipid và do đó làm giảm tổn thương gan cũng như bình
thường hóa các tình trạng bất thường khác nhau như gan nhiễm mỡ và polyp
túi mật [14].
Các nghiên cứu này đã chứng minh tính chống oxy hóa, chống lão hóa
và bảo vệ gan của triterpen bằng cách kiềm chế stress oxy hóa một cách hiệu
quả.
Ngoài ra, tác dụng chống oxi hóa của các loài nấm Linh chi còn được
chứng minh qua hoạt tính sinh học của polysaccharit. Một nghiên cứu chéo
12


ngẫu nhiên, mù đôi đã được thực hiện giữa viên nang là dịch chiết nấm L inh chi
được làm giàu polysaccharit (GL) và viên nang giả dược với 90% là tinh bột
được thực hiện bởi Hui Fang Chiu và cộng sự. Kết quả nghiên cứu thu được

các đối tượng được điều trị GL cho thấy sự giảm đáng kể mức độ của các
dấu hiệu stress oxy hóa khác nhau. Hơn nữa, các tổn thương gan đã được bình
thường hóa khi điều trị bằng GL. Do đó, nhóm tác giả đã kết luận rằng GL
được làm giàu với polysaccharit có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chống oxy
hóa, chống lão hóa và bảo vệ gan thông qua việc làm giảm quá mức các gốc
tự do và do đó bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại [14].
ở

Năm 2011 Kao cùng các cộng sự báo cáo rằng β-1,3-glucan (một
glucan trọng lượng phân tử thấp) được phân lập từ G. lucidum có thể tăng
đáng kể (40% - 80%) khả năng sống sót của dòng tế bào đại thực bào bạch
cầu đơn nhân chuột (RAW 264,7) với stress oxy hóa do H 2O2 gây ra, và giảm
sự hình thành các loại gốc tự do oxy hóa (ROS) [27].

bệnh. Tuy nhiên, các cơ chế hoạt động chống vi khuẩn của nấm Linh chi vẫn
chưa được xác định rõ ràng [15].
Các hợp chất sterol của G.applanatum, được tìm thấy có hoạt tính phổ
kháng khuẩn rộng và tác dụng diệt khuẩn [15]. Ganomycins A và B từ
G.pfeifferi thể hiện hoạt động chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương
[34].
Ngoài ra, Wang và cộng sự đã phân lập được protein kháng nấm 15
kDa, được xác định là ganodermin, từ G.lucidum [45].
1.1.3.5.

Tác dụng trên hệ thần kinh

Stress oxy hóa là một lý do cho sự tiến triển của nhiều bệnh thoái hóa
thần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Huntington, bệnh xơ cứng teo cơ và bệnh
Alzheimer (AD). Một trong những cách tiếp cận để điều trị AD là kiểm soát
chức năng của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine trong não thông qua
việc ức chế acetylcholinesterase (AChE). Zhang và cộng sự đã báo cáo rằng
hỗn hợp các hợp chất triterpen trong G.lucidum thúc đẩy sự tồn tại của tế bào
thần kinh và giảm mệt mỏi. Và người ta đã chứng minh rằng việc tiếp tục
uống G.lucidum có thể cắt giảm sự tiến triển của bệnh Alzheimer [49].
Bên cạnh đó, nghiên cứu của Huang và cộng sự cho thấy rằng
polysaccharit của nấm Linh chi cũng đại diện cho một sản phẩm tự nhiên có tiềm
năng lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị sớm AD. Phát hiện của nhóm tác giả
cho thấy polysaccharit có thể phục vụ như một tác nhân trị liệu tái tạo để điều trị
suy giảm nhận thức liên quan đến các bệnh thoái hóa thần kinh [23].

Ngoài ra, từ thời cổ đại, G.lucidum được sử dụng như một thuốc giảm
đau và có đặc tính thư giãn [15], Matsuzaki và cộng sự cũng đã báo cáo rằng
chiết xuất nước giàu polysaccharit thể hiện tác dụng chống trầm cảm và giảm
hành vi lo lắng ở chuột [33].