ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

ĐINH THỊ NGUYỆT ÁNH

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH
CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG
CÂY CỎ NHỌ NỒI (Eclipta alba)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: ĐINH THỊ NGUYỆT ÁNH

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH
CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG
CÂY CỎ NHỌ NỒI (Eclipta alba)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa

: QH.2014.Y

Người hướng dẫn: 1. Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh
2.

13C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
(Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

1H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

CC

Sắc ký cột (Column Chromatography)

DCM

Dicloromethan

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DM

Dung môi

DMSO

Dimethyl sulfoxide



SK Đ

Sắc ký đồ

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

UV-Vis

Phổ tử ngoại (Ultra violet- Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton.................................. 19
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin......................................... 20
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat.................................. 22
Hình 1.1. Cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)....................................................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid.............................................................. 5
Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất Coumestan......................................................... 5
Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid........................................................... 6
Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất Sterol................................................................... 6
Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1......................................... 7
Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2......................................... 8
Hình 1.8. Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen.............................8
Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi........................ 15
Hình 3.2. Sơ đồ phân l ậ p các hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của Cỏ nhọ
nồi............................................................................................................................................... 16

3.1. Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl
acetat........................................................................................................................................................ 15
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi...................................................................... 15
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi.............................................. 16
3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi................................. 18
3.2.1. Biện luận cấu trúc N01................................................................................................ 18
3.2.2. Biện luận cấu trúc N02................................................................................................ 20
3.2.3. Biện luận cấu trúc N03................................................................................................ 21


3.3. Bàn luận......................................................................................................................................... 23
3.3.1. Về chiết xuất................................................................................................................... 23
3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất.......................................... 23
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới rất thuận lợi cho sự phát triển của
nhiều loại cây thuốc. Với sự đa dạng, phong phú về cây thuốc đã tạo ra nguồn tài
nguyên dược liệu vô cùng quý báu cho nước ta. Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng
những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thườ ng gặp như:
cảm, sốt, chảy máu, đau bụng,… Đó là những bài thuốc được sử dụng rất phổ biến
và được truyền lại từ đời này sang đời khác. Tuy nhiên những bài thuốc này mới chỉ
dựa trên kinh nghiệm của cha ông ta mà chưa có cơ sở về khoa học.
Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì con người đã đi sâu vào nghiên
cứu làm sáng tỏ các thành phần, cấu trúc, tác dụng,… của các loài cây thường được sử
dụng trong các bài thuốc dân gian. Trong các nghiên cứu y dược hiện đại, các hợp

họ lớn nhất trong lớp này, với hơn 1.600 chi và 23.000 loài. Chúng thường tập trung
chủ yếu ở đồng cỏ và thảm thực vật trên núi, ít gặp hơn trong các vùng rừng nhiệt
đới ẩm với độ cao thấp. Họ Cúc là họ thực vật nổi bật trong số các loài thực vật
được sử dụng bởi các dân tộc trong các nền văn hóa bản địa ở tất cả các nơi trên thế
giới, đặc biệt là cho các mục đích y học [8].
Các loài thuộc họ Cúc có các đặc điểm: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính,
chùm lông trên quả, quả là loại quả bế tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi
chín [1].
Họ Cúc có chứa các chất chuyển hóa thứ c ấp phong phú và đa dạng, sự phát triển
của các hợp chất này rất quan trọng trong sự tiến hóa của họ. Nguồn thông tin về các
hợp chất này rất có giá trị trong việc phân loại; sự xuất hiện hoặc vắng mặt của các hợp
chất hóa học cụ thể hoặc nhóm hợp chất thường biểu thị mối quan hệ phân loại
ở phân họ và cấp thấp hơn [8].

1.2 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
1.2.1 Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là Eclipta
alba hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae) [1], [2].

Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có
vị trí phân loại như sau:
Giớ i Th ực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida
Phân lớp Cúc: Asteridae
Bộ Cúc: Asterales
Họ Cúc: Asteraceae
Loài: Eclipta alba
2


Các nghiên cứu khác nhau về thành phần hóa học đã cho thấy cỏ nhọ nồi có
chứa nhiều hợp chất hóa học bao gồm coumestans, alkaloids, glycosides,
flavonoids, triterpenoids, saponins, lipids, hợp chất polyacetylen, steroids,
phytosterol,….Trong lá cây có chứa wedelolactone, demethylwedelolactone,
demethylwedelolactone-7-glucoside, stigmasterol và β-terthienylmethanol. Rễ chứa
hentriacontanol và heptacosanol [15]. Phần trên mặt đất chứa phytosterol, β-amyrin
trong chiết xuất n-hexane và luteolin-7-glucoside, β- glucoside của phytosterol,
glucoside của axit triterpenic và wedelolactone [23].
a. Alkaloid
Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên Eclipta alba cho thấy sự xuất
hiện của các alkaloid như ecliptine và nicotine, và các alkaloid steroid có hoạt tính
sinh học verazine, dehydroverazine ecliptalbine. Năm 1998, M. S. Kader và cộng sự
(Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần dịch chiết methanol của
Eclipta alba được tám hợp chất alkaloid có khung steroid. Alkaloid chính được xác
định là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1), (20R)verazine (2) và các alkaloid khác được xác định là 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6dihydro-4,5 dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene3β,23-diol] (4), (20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6), (20R)-25βhydroxyverazine (7) và 25 β -hydroxyverazine (8) [4].

4


1 R1=R2=H
6 R1=OH, R2=H
8 R1=H, R2=OH

3

4

Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid
b. Coumestan
Coumestan là một d ẫ n xuất của coumarin được tìm thấy trong nhiều loại


d. Saponin triterpen
Saponin triterpene là eclalbatin (20), cùng với α-amyrin, axit ursolic và axit
oleanolic đã được phân lập từ Eclipta alba [34], [53]. Năm 1997, S. Yahara và cộng
sự thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản đã phân lập được eclalbasaponin VII-X (2124) [55]. Năm 2008, M. K. Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã
phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III
(26-28) và eclalbasaponin V (29) [40].

25

20 R1 =Glc, R2=H, R3=Ara
26 R1=Glc, R2=OH, R3=Glc
27

R1=Glc, R2=OH, R3=H

Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1

7


21 R=H
23 R=SO3H
Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen
2 e. Dẫn xuất thiophen và polyacetylen
Năm 1966, F. Bolhman và cộng sự thu ộc Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức
đã phân lập 2 dẫn xuất thiophen (30, 31) và polyacetylen (32) từ lá khô của cỏ nhọ nồi.
Cùng năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự tại Đại học Delhi Ấn Độ đã xác định
được cấu trúc của α-terthienyl methanol (33) từ Eclipta alba. Năm 1985,
P. Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và

nghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng.
Sử dụng liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol của cỏ nhọ nồi bằng đường
uống cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể trên mô hình gây phù chân chuột bằng
carrageenin và lòng trắng trứng được so sánh với indomethacin (10mg/kg) và
cyproheptadine (8 mg/kg) [9].
b. Tác dụng kháng khuẩn, chống nấm
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tiềm năng chống vi khuẩn của Eclipta alba
và đã chỉ ra rằng Eclipta alba có đặc tính kháng khuẩn. Các nghiên cứu cho thấy rằng
các hợp chất thu được từ Eclipta alba cho hoạt động tốt chống lại Staphylococcus
aureus, Eclipta Coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella typhimurium [18].

Cỏ nhọ nồi có tác dụng chống lại các chủng nấm: Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus, Fusarium solani và Aspergillus flavus. Hoạt tính kháng nấm
in vitro c ủ a dịch chiết Eclipta alba đã được nghiên cứu chống lại nấm Candida
tropicalis, Rhodotorula glutinis và Candida albicans [29].

9


c. Tác dụng bảo vệ gan
Dịch chiết ethanol/nước (1:1) của Eclipta alba ức chế tác dụng của CCl 4 và
điều chỉnh các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan (amidopyrine-Ndemethylase và glucose-6-phosphatase liên kết màng). Nghiên cứu cho th ấy rằng
hoạt động bảo vệ gan của Eclipta alba là sự điều chỉnh mức độ của các enzyme
chuyển hóa thuốc của microsome gan. Các dịch chiết methanol của lá và dịch chiết
chloroform của rễ Eclipta alba cho thấy các hoạt động tương ứng làm giảm 72,8%
và 47,96% enzyme lysosomal. Từ dịch chiết methanol của lá, triterpenoid
eclabasaponin làm giảm 78,78% và alkaloid làm giảm 60,65% lượng CCl 4 làm tăng
enzyme lysosomal trong máu. Coumestan và saponin triterpenoid từ dịch chiết
chloroform của rễ tương ứng làm giảm 75,6% và 52,41% nồng độ CCl 4. Eclipta
alba được báo cáo là có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương gan cấ p tính do CCl 4,

thư của nó chống lại Ehrlich Ascites Carcinoma (EAC) ở chuột bạch tạng. Hoạt
động chống ung thư được kiểm tra bằng cách xác định khối lượng khối u, số lượng
tế bào khối u, số lượng tế bào khối u còn sống, số lượng tế bào khối u không th ể
sống, thời gian sống trung bình và tăng tuổi thọ trong các mô hình động vật thí
nghiệm. Dịch chiết làm tăng tuổi thọ của chuột được điều trị EAC và khôi phục các
thông số huyết học so với chuột mang EAC [25].
Coumestans cũng được biết là hoạt động như phytoestrogen. Ở nhiều nước,
nó được sử dụng như chế độ ăn uống đóng vai trò là tác nhân phòng ngừa hóa học
trong ung thư vú và tuyến tiền liệt. Dasyscyphin-C (saponin) một hợp chất phân lập
mới từ Eclipta alba được báo cáo với hoạt tính chống ung thư - gây độc tế bào [40].
g. Ngăn rụng tóc, kích thích mọc tóc
Eclipta alba được sử dụng trong các ch ế phẩm dưỡng tóc vì nó thúc đẩy
mọc tóc và duy trì độ đen của tóc. 10% w/v của Eclipta alba là thành phần chính
trong việc điều chế công thức thảo dược hỗ trợ cho sự phát triển của tóc.
Eclipta Alba là một loại thảo dược phổ biến để kích thích sự phát triển của
tóc. Dịch chiết ether và dịch chiết ethanol đã được phối hợp vào dạng kem (nước
trong dầu) và bôi tại chỗ trên da bị bong tróc của chuột bạch tạng trong một thử
nghiệm. Thời gian cần thiết để bắt đầu phát triển tóc cũng như hoàn thành chu kỳ
tăng trưởng tóc được ghi lại. Dung dịch Minoxidil 2% được áp dụng tại chỗ và đóng
vai trò chứng dương để so sánh. Kết qu ả điều trị với dịch chiết ether 2% và 5% tốt
hơn so với minoxidi 2% (chứng dương) [46].
h. Tác dụng hạ đường huyết
Về tác d ụng hạ đường huyết, sử dụng Eclipta alba qua đường uống trong 2
tháng đã đượ c chứng minh là làm giảm glucose máu, glycosylated hemoglobin
HbA1c, gi ảm hoạt động của glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase,
và tăng hoạt động của hexokinase gan. Eclipta alba đã được chứng minh có hoạt
động trị tiểu đường và lợi tiểu bằng cách tác động lên tuyến tụy nhờ phục hồi và tái
tạo hoạt động tế bào β của tụy [8].

11

- Tủ sấ y Memmert, Binder-FD115.
- Máy siêu âm Power sonic 405.
- B ếp điện, bếp cách thủy Memmert.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Detector Diode array.
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, Máy đo

hàm ẩm.
- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.

12


- Dụng cụ thủy tinh: Bình gạn 1000ml, bình nón 250ml, bình cầu các dung

tích 250ml, 500ml, 1000ml, cột sắc ký các loại, phễu thủy tinh, ống đong, ống nghi
ệ m các kích thước,…
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập
- Cỏ nhọ nổi được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với methanol,

sau đó lọc loại bã dược liệu và gộp dịch chiết. Tiếp theo cất thu hồi dung môi dưới
áp suất giảm thu được cao đặc toàn phần.
- Cao toàn phần được phân tán trong nước và chiết phân đoạn lần lượt với

dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat thu được các phân đoạn
tương ứng.
- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là

silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) kết h ợ p với phương pháp kết tinh
lại trong dung môi. Tiến hành quá trình sắc ký cột:

- Phổ khối lượng: Cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ

phân tử. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ
ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau
sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử,
cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một
chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với ph ổ khối của một chất
đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [3].
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Khi đặ t một chất có hạt nhân có số spin (I)
1

lẻ ( H,

13

C...) được đặt trong một từ trường ngoài (B 0), các spin hạt nhân sẽ được sắp

xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân
bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức
xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng
(cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường).
Khi ngưng chiếu xạ, các spin h ạ t nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái
cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử
hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. Tùy
vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ

khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C) như trong các
phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại
hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [3].
Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất được phân

1. Chiết với MeOH, 700C, 3 lần
2. Lọc lấy dịch
3. Cô quay

Cao tổng (NTP)
(288,3g)
1. Phân tán cao trong nước
2. Lắc phân đoạn lần lượt với
n-hexan (x3), EtOAc (x3)

Cao

Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi

15


3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi
Dùng 60g cao phân đoạn NE tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel vớ i
hệ dung môi gradient là: DCM-MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) thu được 7
phân đoạn ký hiệu là: NE1-7.
Sắc ký cột pha thường phân đoạn NE4 (5,3g) với hệ dung môi DCM-MeOH
(10/1) thu được phân đoạn ký hiệu là: NE4.1- 4.4. Phân đoạn NE4.1 (1,9g) được
tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu
được hợp chất N01 (426mg) và N02 (112mg). Phân đoạn NE4.2 (1,1g) được tiến
hành tiến hành sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (8/1), kết
tinh lại thu được hợp chất N03 (48 mg).
NE (60g)
CC: pha thường
DCM/MeOH (100%, 30/1, 20/1,

UV 254nm

Hình 3.3. SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc

N02

NE

UV 254nm

Hình 3.4. SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc

N03

NE

UV 254nm

Hình 3.5. SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc


17