46

CHƯƠNG 4
PHÂN TÍCH VI SINH 4.1. Đại cương về vi sinh vật
4.1.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật
Vi sinh vật(VSV) là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ,
muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi.
Virut là nhóm VSV đặc biệt, chúng nhỏ bé tới mức chỉ có thể quan sát được
qua kính hiển vi điện tử. Virut chưa có cả cấu trúc tế bào. Các VSV khác thường là
đơn bào hoặc đa bào nhưng có cấu trúc đơn giản và chưa phân hóa thành các cơ quan
sinh dưỡng.
VSV không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc
về nhiều giới sinh vật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có không có quan hệ
mật thiết với nhau. Chúng có chung những đặc điểm sau đây:

- Kích thước nhỏ bé.
Mắt con người khó thấy được rõ những vật nhỏ hơn 1nm.
Vậy mà VSV thường được đo bằng
µ
m, virut thường được đo bằng nm. Vì vi sinh vật
có kích thước nhỏ

bé cho nên diện tích bề mặt của một tập đoàn VSV hết sức lớn.
Chẳng hạn số lượng cầu khuẩn chiếm thể tích 1cm
3
có diện tích bề mặt là 6m

- 10
9
tế bào. Thời gian thế hệ của
nấm men Saccharon cerevisiae là 120 phút. Khi nuôi cấy để thu nhận sinh khối
(biomass) giàu protein phục vụ chăn nuôi, người ta nhận thấy tốc độ sinh tổng hợp của 47

nấm men này cao hơn của bò tới 100.000 lần. Thời gian thế hệ của tảo Chlorella là 7
giờ, của vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ.

- Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị.
Năng lực thích ứng của
VSV vượt rất xa so với động vật và thực vật. Trong quá trình tiến hóa lâu dài, VSV đã
tạo cho mình những cơ chế điều hòa trao đổi chất để thích ứng được với những điều
kiện sống rất bất lợi. Người ta nhận thấy số lượng enzim thích ứng chiếm tới 10%
lượng chứa protein trong tế bào sinh vật. Sự thích ứng của vi sinh vật nhiều khi vượt
quá sự tưởng tượng của con người. Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên sức sống ở
nhiệt độ của nitơ lỏng (-196
0
C), thậm chí ở nhiệt độ hidro lỏng (-253
0
C). Một số vi
sinh vật có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 250
0
C, thậm chí 300
0
C. Một số vi sinh vật có thể
thích nghi với nồng độ 32% NaCl (muối ăn), vi khuẩn Thiobacillus thioxidans có thể
48

Nhà vi sinh học Nga nổi tiếng đã viết “VSV mà ta biết đến hiện nay nhiều lắm
cũng không quá được 10% tổng số VSV có sẵn trong thiên nhiên”. Chẳng hạn về nấm,
trung bình mỗi năm bổ sung thêm 1.500 loài mới.
Trong quá trình hoạt động sống, bên cạnh những đặc tính có ích, VSV cũng gây
nhiều tác hại cho người, động vật, thực vật như : làm biến đổi chất lượng thuốc, hỏng
thực phẩm, một số có khả năng gây bệnh hoặc sinh độc tố có hại
Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thực phẩm và thuốc bằng các thử nghiệm
VSV ta cần tìm hiểu một số đặc điểm chính của 2 nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi
nấm
4.1.2. Vi khuẩn (Bacteria)
4.1.2.1. Đặc điểm
Vi khuẩn là những VSV đơn bào có cấu tạo tế bào tiền nhân(Procaryote), có
kích thước rất nhỏ. Đường kính tế bào phần lớn thay đổi trong khoảng 0,2 - 2
µ
m,
chiều dài từ 2 - 8
µ
m. Vi khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau, như hình cầu, hình que,
xoắn, dấu phẩy. Vi khuẩn chỉ sinh sản vô tính, một số tạo bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn
chỉ có một bào tử. Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ sự có mặt của một hoặc
nhiều lông.
4.1.2.2. Phân loại
Việc phân loại vi khuẩn rất phức tạp, phải dựa vào nhiều đặc điểm, hình thái,
sinh lý, sinh hóa để chia vi khuẩn thành các họ, chi, loài khác nhau. Với mục đích
phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm, ta không đi sâu vào nghiên
cứu phân loại, nhưng cần tìm hiểu vi khuẩn, theo các nhóm dựa trên hình thể, tính chất

gian và tuân theo một quy luật nhất định bao gồm 4 pha: Pha lag, pha logarit, pha ổn
định và pha tử vong.
Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng có thể quan sát sau khoảng
18-24 giờ nuôi cấy. Chúng có thể làm đục môi trường, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng
cặn ở đáy ống nghiệm.
Trên các môi trường đặc, khuẩn lạc của các vi khuẩn thường nhỏ hơn khuẩn lạc
của vi nấm, bề mặt nhẵn, bóng, ướt hoặc nhăn nheo, ... Khuẩn lạc của vi khuẩn tạo sắc
tố với các màu như: trắng (Staphylococcus albus), vàng (Staphylococcus aureus), hồng
(Micrococcus), xanh (Pseudomonas aeruginosa), ... Mỗi vi khuẩn có đặc tính riêng về
hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Các đặc tính này giúp cho việc xác định vi
khuẩn trong quá trình kiểm nghiệm dược phẩm.
4.1.3. Vi nấm (Microfungi)
4.1.3.1. Đặc điểm:
Vi nấm có cấu tạo tế bào nhân thật (Eucaryote). Tế bào vi nấm rất nhỏ, muốn
quan sát cần dùng kính hiển vi. Nấm không có chất diệp lục, sống hoại sinh hoặc ký
sinh, sinh sản vô tính hoặc hữu tính.
Vi nấm bao gồm hai loại là nấm men và nấm mốc. Trong kiểm nghiệm vi sinh
vật, cần phát hiện hai loại này có trong dược phẩm, thực phẩm.
4.1.3.2. Nấm men (Yeast): 50

Nấm men có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng nẩy chồi. Tế bào nấm men
có kích thước, hình dạng khác nhau tùy loài. Chúng có thể hình cầu, bầu dục, hình quả
chanh, hình ống, ...
Khuẩn lạc nấm men bao gồm nhiều cá thể thường thuộc một loài phát triển từ
một cá thể mẹ tạo thành một khối. Khuẩn lạc nấm men thường to hơn khuẩn lạc vi
khuẩn, bề mặt có nếp nhăn hoặc trơn nhẵn, không tạo sợi.
Nấm men thường được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm như làm


51

Các yếu tố bên ngoài có ảnh hưởng đến đời sống của VSV là vật lý, hóa học và
sinh học, trong đó, các yếu tố vật lý là đáng chú ý nhất. Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt
độ, độ ẩm và ánh sáng.
4.1.4.1. Nhiệt độ:
Nhiệt đố là yếu tố quan trong nhất đối với đời sống VSV. Mỗi loài VSV có một
giới hạn nhiệt độ phát triển thích hợp. Nói chung đối với VSV, nhiệt độ phát triển
thường từ 15 - 45
0
C.
Ở nhiệt độ cao sẽ làm thay đổi quá trình trao đổi chất của VSV, VSV bị chết.
Các tế bào sinh dưỡng thường bị chết ở nhiệt độ 60
0
C trong khoảng 20 - 30phút.
Các bào tử chỉ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 120
0
C trong khoảng 30 - 40phút. Tính chất
này được ứng dụng trong việc tiệt trùng. Nhiệt độ thấp chỉ có tác dụng kìm hãm sự
phát triển của VSV (trừ VSV ưa lạnh).
4.1.4.2. Độ ẩm:
Hầu hết quá trình sống của VSV có liên quan đến nước. Khi thiếu nước xảy ra
hiện tượng loại nước khỏi tế bào VSV, trao đổi chất bị giảm, tế bào sẽ chết. Vì vậy, để
bảo quản thực phẩm, dược phẩm, dược liệu tránh khỏi tác động của VSV cần có một
giới hạn độ ẩm nhất định.
4.1.4.3. Ánh sáng:
Ánh sáng mặt trời gồm các tia bức xạ như: tử ngoại, hồng ngoại, gamma có tác
dụng phá hủy tế bào VSV, đặc biệt là tia tử ngoại. Bức xạ UV bước sóng 260nm có tác
dụng diệt khuẩn mạnh nhất. Dưới ảnh hưởng của UV, VSV bị chết hoặc đột biến tùy

- Cân đong nguyên liệu: Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là
những hóa chất hoặc nguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối, mật, sắt,...)
phải được cân bằng cân phân tích.
- Hòa tan nguyên liệu: thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi
trường. Các hóa chất được hòa tan nóng, lạnh tùy theo tính chất của chúng. Môi
trường không có thạch nên hòa tan lạnh hoặc nóng nhẹ. Môi trường có thạch cần đun
cho thạch tan hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào.
- Điều chỉnh pH: Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ
45-50
0
C để pH ít bị thay đổi sau khi tiệt trùng. Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N
thường được sử dụng để điều chỉnh pH. Sau khi điều chỉnh pH cần bổ sung nước cho
đủ thể tích quy định.
- Làm trong môi trường: Các môi trường lỏng (bao gồm các chất hòa tan) phải
trong để dễ quan sát sự phát triển của VSV. Sau khi hòa tan các chất, nếu môi trường
đục cần phải lọc vải gạc hoặc giấy.
- Đóng ống tiệt trùng: Môi trường được cho vào ống nghiệm bình nón hoặc
bình cầu, tùy theo yêu cầu thí nghiệm. Khi đóng ống, không được để môi trường dính
vào miệng ống hoặc bình. Môi trường cần phải được tiệt trùng ngay sau khi đóng gói,
nếu để lâu tạp khuẩn sẽ phát triển làm hỏng môi trường. Các môi trường thông thường
được tiệt trùng ở 110
0
C trong 30 phút hoặc 120
0
C trong 20 phút. 53

Môi trường của các chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt cần được tiệt trùng ở nhiệt độ

- Tiệt trùng bằng hơi nước: Phương pháp dùng nhiệt ướt thường được dùng để
tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật. Môi trường thường được tiệt
trùng bằng nồi hấp ở 121
0
C/ 15phút. Các môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt như môi
trường có đường, sữa, bia, máu, ... cần tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng các phương pháp
sau:
Tiệt trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall): Môi trường được hấp 3 - 4 lần ở
nhiệt độ không quá 100
0
C trong 30 - 40phút, cách nhau 24giờ. Giữa hai lần hấp cho
môi trường vào ủ ở 28-32
0
C/ 24giờ cho bào tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm
sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp theo.
Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur): Đun cách thủy môi trường
60
0
C/ 30phút hoặc 73
0
C/ 15phút sau đó làm lạnh đột ngột dưới 10
0
C. Phương pháp
này không diệt được bào tử.
- Phương pháp lọc: được dùng để tiệt trùng các chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt.
Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc
≤
0,22
µ
m. Phần chảy qua phễu

0
C trong môi trường.
Coliforms có khả năng sinh indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở nhiệt độ 44,5
0
C trong
canh trường Tryphon.
Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động
vật máu nóng khác. Xác đinh Coliforms và E.Coli cho biết mức độ ô nhiễm và tình
trạng vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống
cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân trong sản phẩm.
4.2.1. Phương pháp MPN
4.2.1.1. Nguyên tắc
Mẫu được pha loãng ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau mỗi độ pha
loãng được cấy trong 3 (hoặc 5) ống nghiệm lặp lại có chứa môi trường tăng sinh chọn
lọc có ống Durham. Sau thời gian nuôi cấy, quan sát, theo dõi và sinh hơi và đổi màu
để định tính sự hiện diện của từng ống nghiệm: đây là các ống dương tính. Ghi nhận
các ống dương tính ở mỗi độ pha loãng và cấy tiếp sang môi trường khẳng định BGBL
2%. Từ các ống nghiệm có phản ứng dương tính, tra bảng Mac Grady để suy ra số
lượng Coliforms hiện diện trong 1g (1ml) mẫu phân tích.
4.2.1.2. Dụng cụ, thiết bị

- Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Ống Durham
- Ống nghiệm - Pipet
- Tủ sấy - Cồn 70
0

- Tủ hấp - Tủ ấm 55

, 10
-2
, 10
-3
vào các ống
nghiệm có chứa môi trường TLS, mỗi độ pha loãng làm 3 ống nghiệm lặp lại.
−

Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 37
0
C 1
0
C trong thời gian 24
- 48 giờ. Quan sát và ghi nhận các ống có sinh khí và đục (kết quả dương tính).
−

Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm dương tính sang các ống
nghiệm có chứa môi trường BGBL 2%. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ
37
0
C 1
0
C trong thời gian 48 giờ. Với mỗi độ pha loãng, tính tổng số (kết quả dương
tính). sinh khí và đục ((kết quả dương tính).
4.2.1.5. Kết quả

Dựa vào số ống có kết quả dương tính của mỗi độ pha loãng, xác định số đặc
trưng và sau đó là chỉ số MPN, từ đó tính được số Coliforms có trong 1g(1ml) mẫu
phân tích.
4.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc