Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên h t t p: / / w w w . l r c - t nu . e d u . v n
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TR
Ƣ
ỜNG ĐẠI HỌC
SƢ
PHẠM
–––––––––––––––––––––––––
HỨA THỊ NGA
NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH
VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ
CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN -
2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên h t t p: / / w w w . l r c - t nu . e d u . v n
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TR
Ƣ
ỜNG ĐẠI HỌC
SƢ
PHẠM
–––––––––––––––––––––––––
HỨA THỊ NGA
NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH
VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ
CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng

NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim
Hƣơng,
CN Vũ Hải Chi - cán bộ
nghiên cứu trong phòng quan tâm, hƣớng dẫn và cho tôi những lời khuyên
quý báu. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào
Tạo thuộc Khoa Sinh - KTNN,
Tr
ƣ
ờng
Đại học
Sƣ
phạm, Đại học Thái
Nguyên.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả luận
văn
Hứa Thị
Nga
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên h t t p: / / w w w . l r c - t nu . e d u . v n
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng
đƣợc
công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận
văn
Hứa Thị

Cộng sự
Cytozin
Dideoxynucleside triphosphate
Deoxynucleside triphosphate
Deoxyribonucleic acid
Displacement loop - đoạn điều khiển ty thể
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Ethidium brommide
Ethanol
Eppendorf
Guamin
kilo base
kilo Dalton
DNA ty thể (mitochondrial DNA)
Nhà xuất bản
Nicotinamide adenine dinucleotide
Phosphate - buffer saline
Polymerase Chain Reaction
Ribonucleic Acid
Ribonuclease
Sodium Doecyl Sulphate
Timin
Tris - Acetate - EDTA
Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen
...........................................
28
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt
.............................................................................

42
Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh.
.............................
43
MỤC LỤC
MỞ
ĐẦU

.......................................................................................................
1
1. Lý do chọn đề
tài
........................................................................................................
1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề
tài
.................................................................................
2
3. Nội dung nghiên cứu
.................................................................................................
3
Ch
ƣ
ơng
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
..........................................................
4
1.1. SƠ
LƢỢC
VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

vật
......... 11
1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ
GÀ

................................................................
12
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể
........................................................
12
1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể
.........................................................
13
1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty
thể

...........................................................
14
1.4.4. MtDNA của động vật có
xƣơng
sống và mtDNA
gà

...........................
14
1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế
giới ..............................
17
1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt
Nam...............................

.................
23
2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel
agarose

................................................
24
2.3.3.
Ph
ƣ
ơng
pháp điện di SDS-PAGE
.......................................................
25
2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật
PCR

..............................
27
2.3.5. Tinh sạch sản phẩm
DNA

...................................................................
29
2.3.6.
Ph
ƣ
ơng
pháp xác định trình
tự

KHẢO..........................................................................
47

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên h t t p: / / w w w . l r c - t nu . e d u . v n
1. Lý do chọn đề tài
MỞ ĐẦU
Gần một thế kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm
đƣợc
cả thế giới quan tâm
và phát triển mạnh cả về số lƣợng và chất lƣợng. Chăn nuôi gia cầm chiếm
một vị trí quan trọng trong
chƣơng
trình cung cấp protein động vật cho con
ngƣời.
Gia cầm chiếm 20-25% trong tổng sản phẩm thịt, ở các
nƣớc
phát triển
thịt gà chiếm tới 30% hoặc hơn thế nữa.
Ở
nƣớc
ta ngành chăn nuôi gia cầm là một nghề sản xuất truyền thống,
giữ vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất. Đàn gia cầm ở
nƣớc
ta
phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (66%), ở các
tỉnh phía Nam chiếm 34%. Đàn vịt thì
ngƣợc
lại phân bố chủ yếu ở các tỉnh
phía Nam (60%) và ở miền Bắc đàn vịt chỉ chiếm khoảng 40%.

chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10].
Hiện nay 75-80% chăn nuôi gà ở nƣớc ta là sử dụng các giống địa
phƣơng,
nuôi gà chăn thả với các giống truyền thống địa
phƣơng
cũng không
ngừng phát triển và hiệu quả ngày càng tăng bởi các giống địa phƣơng đã
đƣợc
đầu
tƣ
để bảo tồn quỹ gen nhằm chọn lọc nâng cao năng suất. Các giống
gà nội của ta mặc dù có hạn chế về năng suất,
nhƣng
khả năng thích ứng với
điều kiện chăn nuôi Việt Nam cao, phẩm chất trứng thịt tốt đặc biệt là một số
giống gà còn có giá trị
dƣợc
liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe của con
ngƣời. Gà Ri của ta, gà của ngƣời H'Mông là một trong những giống gà có
phẩm chất quý đó.Và một giống gà hiện đƣợc rất nhiều ngƣời quan tâm về
phẩm chất, tác dụng của nó đó là gà Đa cựa.
Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi dựa vào những đặc điểm
hình thái còn dựa vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh hóa. Các đặc tính này
chịu sự kiểm soát bởi các gen, thuộc hệ gen của cơ thể sinh vật và sự tƣơng
tác giữa các gen với môi
tr
ƣ
ờng.
phân tích đa hình protein huyết thanh của
các giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng của các giống gà thí nghiệm, so sánh

pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện của
ba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba
giống gà nói trên.
Chƣơng
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ
L
Ƣ
ỢC
VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC
ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU
1.1.1. Sơ
lƣợc
về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà
Các giống gà hiện nay
đƣợc
hình thành từ quá trình lai tạo, tiến hóa lâu
dài và phức tạp của 4 loại hình sau của gà rừng.
- Gallus Bankiva: Phân bố ở Miến Điện, Đông
D
ƣ
ơng
và
Philippin.
- Gallus Soneratii: Phân bố ở Tây và Nam Ấn Độ.
- Gallus Lafazetti: Phân bố ở Sri Lanca.
- Gallus Varius: Phân bố ở Inđônêxia.
Ở các vùng thung lũng sông Ấn, sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà diễn
ra ở thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm
trƣớc

Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà của ta bắt nguồn từ gà rừng
Gallus bankiva hay còn có tên là Gallus gallus. Cách đây khoảng 3000 năm từ
giống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian dài nhân dân ta đã tạo ra đƣợc
nhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, và gà Ri
đƣợc
phân bố rất rộng rãi.
Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà ở
nƣớc ta đã có từ giai đoạn Phùng Nguyên cách đây 3500 năm. Cơ sở của kết
luận này là
tƣợng
gà bằng đất nung tìm thấy ở xóm Rền, Đồng Đậu, Vĩnh
Phúc.
Theo Nguyễn Đức Tâm [9] nghề nuôi gà ở
nƣớc
ta muộn hơn cách đây
khoảng 3328 ± 100 năm, đến giai đoạn Đông Sơn (2800 ± 100 năm) đã có
tƣợng
gà bằng đồng khá phổ biến.
Theo tác giả Đào Văn Tiến (1971) [11] thì gà
đƣợc
nuôi cách đây 3000
năm. Theo các tài liệu nghiên cứu về khảo cổ và di chỉ tìm
đƣợc
cho
thấy
vùng nuôi gà sớm nhất ở
nƣớc
ta nằm giữa hai dãy núi Ba Vì và Tam Đảo. Gà
nuôi lúc bấy giờ tầm vóc còn bé, khả năng sinh sản thấp và đó chính là tổ tiên
giống gà hiện nay. Trải qua thời kì dài làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo

Ri có sức chống chịu bệnh tật cao, thịt có
hƣơng
vị thơm ngon, phẩm chất tốt
[7].
Gà Ri có đặc tính cần cù, chịu khó kiếm ăn, khả năng chống chịu tốt
với thời tiết, bệnh tật, nuôi con khéo, đẻ trứng sớm với khẩu phần ăn nghèo
chất dinh
d
ƣ
ỡng
13-15% đạm thì vẫn nuôi
đƣợc
gà đẻ trứng bình thƣờng.
1.1.2.2. Gà Mông
Ở
nƣớc
ta gà Mông
đƣợc
nuôi chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắc
trong các gia đình dân tộc thiểu số, đặc biệt là
ngƣời
H'Mông, đƣợc nuôi với
phƣơng thức chăn thả quảng canh không có đầu tƣ.
Đặc điểm gần giống với kiểu Bakira, Gà Mông có tầm vóc
t
ƣ
ơng
đối
lớn từ 3 - 4kg, có chân cao, tốc độ sinh
tr

cách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày. Trứng gà Mông có khối
lƣợng
ở mức trung
bình với 44,04g. Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng
12,41. Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01% lòng đỏ trứng có tỷ lệ
lipit khá cao 26,94% [20].
Đặc tính riêng biệt: Da, thịt,
x
ƣ
ơng
và phủ tạng có màu đen chiếm 90%,
ngoại trừ màu lông do quá trình nuôi bị lai tạp,
chƣa đƣợc
chọn lọc nên màu
sắc
lông gà Mông
th
ƣ
ờng
rất đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng......
Về tập tính,
trƣớc
đây, gà Mông đƣợc nuôi thả tự do nên tập tính có
phần hoang dại. Ban ngày gà đƣợc thả rông tự kiếm ăn, tối về chuồng hoặc
đậu trên cây ngủ. Thức ăn có thể là giun, dế, ngô, thóc.....,
ngƣời
nuôi ít cho
ăn thêm.
1.1.2.3. Gà Đa cựa
Là giống gà địa

những thành tựu
vĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh học
của sự sống ở cấp độ phân tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng
dụng vào thực tiễn. Geneomics và Proteomics là vấn đề đang
đƣợc
quan tâm
đặc biệt hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu
trúc và chức năng của axit nucleic, về đặc điểm của genome nhân, genome ty
thể, genome lạp thể. Những đặc điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của
các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống và nghiên cứu ở
ngƣời.
Cùng với cấu trúc DNA và RNA còn có đặc điểm của quá trình tái bản
DNA và phiên mã cũng
đƣợc
quan tâm, vì nó là cơ sở của những kĩ thuật sinh
học phân tử - các thao tác ở DNA và RNA.
Phân loại học phân tử (Molecular systematics ) là sự phát hiện, mô tả
và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài trong phạm
vi loài [16]. Các
phƣơng
pháp dùng trong phân loại phân tử: Hiện nay có hàng
loạt các
ph
ƣ
ơng
pháp đang đƣợc sử dụng trong phân loại học phân tử nhƣ:
Điện di isozym, phản ứng chuỗi polymerase (PCR); Kĩ thuật phân tích hiện
tƣợng
đa hình của độ dài các phân đoạn ADN (RFLP technology); Phân tích
đa hình của ADN

diễn ra một cách
bình thƣờng và do đó cơ thể mới đƣợc tồn tại, sinh
tr
ƣ
ởng
và phát triển
tốt...Các tế bào máu luôn
đƣợc
đổi mới trong cơ thể nhƣng vẫn luôn duy trì
một tỷ lệ
t
ƣ
ơng
đối ổn định.
Việc nghiên cứu các thành phần của máu cũng
nhƣ
các chỉ số sinh lý,
hóa sinh máu có ý nghĩa quan trọng trong công tác giống, chỉ số sinh lý, hóa
sinh đã trở thành hằng số đặc
trƣng
cho phẩm chất giống, quy định đặc tính di
truyền bên trong cơ thể, từ đó cho phép khảo sát và điều tra các chỉ tiêu cho
công tác chọn giống và lai tạo giống gia súc, gia cầm.
Thành phần của máu: Lấy máu và chống đông rồi cho vào một ống
nghiệm, sau đó ly tâm, ta sẽ thấy máu
đƣợc
chia làm hai phần rõ rệt:
- Phần trên có màu vàng nhạt vì có các sắc tố màu vàng và chiếm
khoảng 55-60% thể tích của máu.
- Phần

đệm trong điện di huyết thanh và hemoglobin cho phù hợp với pH của nó.
Trong điện di ngƣời ta sử dụng các dung dịch
đệ
m khác nhau phù hợp với
từng đối
t
ƣ
ợng.
1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết
thanh máu
Trong những năm gần đây, nhờ các
ph
ƣ
ơng
pháp và kỹ thuật phân tích
sinh hóa hiện đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là
phƣơng
pháp điện di và các
phƣơng
pháp nhuộm hóa tế bào đã góp phần quan trọng để nghiên cứu, phát
hiện cấu trúc enzym của protein huyết thanh, sữa, các kiểu hemoglobin…trên
cơ sở đó nghiên cứu cơ chế phân tử của trao đổi chất, hoạt động của gen trong
tế bào. Nhiều dẫn liệu trong lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền của các
tính trạng hóa sinh đã
đƣợc
ứng dụng trong công tác chọn giống vật nuôi một
cách có hiệu quả.
Các tính trạng hoá sinh là những tính trạng muốn xác định nó,
ngƣời
ta

enzym trong máu, trong các dịch của cơ thể.
Protein huyết thanh máu là hỗn hợp các chất khác nhau.
Ngƣời
ta đã đi
sâu chứng minh vai trò quan trọng của các tiểu phần huyết thanh với các quá
trình trao đổi chất và liên quan của chúng với các chỉ tiêu kinh tế khác.
1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật
Tùy theo
phƣơng
pháp xác định thành phần protein huyết thanh mà ta
đƣợc
số tiểu phần (cấu tử) khác nhau.
Ph
ƣ
ơng
pháp điện di trên giấy tách protein huyết thanh bò, lợn đƣợc
bốn tiểu phần chính; Anbumin là tiểu phần chạy nhanh nhất về phía cực
dƣơng,
tiếp theo là các tiểu phần αglobulin, βglobulin, γglobulin.
Về thành phần protein huyết thanh của lợn, gà, cá và một số động vật
nuôi khác khi điện di trên giấy cũng đƣợc 4 tiểu phần chính là anbumin,
αglobulin, βglobulin, γglobulin.
Khi phân tích protein huyết thanh trên gel tinh bột thủy phân, gel
polyacrylamide…số cấu tử sẽ lớn hơn do mỗi tiểu phần ở trên giấy sẽ đƣợc
tách ra nhiều phần nhỏ
nhƣ
tiền anbumin, anbumin, hậu anbumin, α1globulin,
α2globulin βglobulin, γ1globulin, γ2globulin…
Anbumin là nguyên liệu xây dựng các tế bào, anbumin huyết thanh
đóng vai trò giữ áp lực thẩm thấu keo, vận chuyển và liên kết axít béo,

nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể. Thông qua hệ thống miễn dịch, các globulin
miễn dịch đã bảo vệ cho cơ thể, và có vai trò trong bảo tồn nòi giống [2].
1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể
Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào hô hấp hiếu khí, có chức
năng vô cùng quan trọng là trạm chuyển hóa năng
lƣợng
từ các phân tử dinh
dƣỡng
thành dạng năng
lƣợng
tích trữ trong phân tử ATP là dạng năng
l
ƣ
ợng
cần thiết cho tất cả các hoạt động sống của tế bào.
Ty thể đƣợc Altman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897
đ
ƣ
ợc
Benđa đặt tên là Mitochondria (theo tiếng Hy Lạp- Mistos là sợi và chondira-
là hạt) vì chúng có dạng sợi hoặc dạng hạt khi xem
dƣới
kính hiển vi thƣờng.
Ty thể là những thể nhỏ có màng bao bọc, số
lƣợng
ty thể trong các tế
bào rất khác nhau, có thể hàng trăm hoặc hàng nghìn. Ty thể có nhiều hình
dạng khác nhau
nhƣ

tiếp nhận các sản phẩm
đƣợc
phân giải từ các chất
nhƣ
protein, lipit và gluxit
diễn ra trong bào
t
ƣ
ơng
đến dạng pyruvat và chuyển sang dạng Axetyl
coenzimA. Trong ty thể, axetyl coenzimA đã qua quá trình oxy hóa trong chu
trình Krebs. Với chu trình này, đã có bốn lần giải phóng 2H
+
nghĩa là giải
phóng hai điện tử. Các ion H
+
giải phóng ra
đƣợc
các chất vận chuyển H
+
tiếp
nhận chuyển vào chuỗi hô hấp và cuối cùng chuyển hydro cho oxy. Trong
chuỗi hô hấp, năng
lƣợng
giải phóng
đƣợc
tích lại
dƣới
dạng ATP. Ty thể còn
có đặc điểm là trong dịch nền của nó có những hạt DNA và ARN. Ty thể đã

với dẫn chứng là nhiều bọn vi khuẩn có cấu trúc mezoxom - là một phần của
màng sinh chất gấp nếp ăn sâu vào tế bào chất, có chứa các enzym và nhân tố
của sự hô hấp hiếu khí - đó là hình ảnh của ty thể ở dạng nguyên thủy.
Nh
ƣ
ng
hiện nay ngƣời ta công nhận giả thuyết cộng sinh về nguồn gốc chủng loại
của ty thể. Sự xuất hiện ty thể trong tế bào Eukaryota là kết quả cộng sinh của
một dạng vi khuẩn hiếu khí với tế bào. Dẫn chứng thuyết phục nhất là trong ty
thể có chứa DNA giống DNA của vi khuẩn, riboxom của ty thể về kích
th
ƣ
ớc
và rARN giống với riboxm vi khuẩn, và đặc biệt là cơ chế và hoạt động tổng
hợp protein trong ty thể có nhiều đặc điểm giống với vi khuẩn.
1.4.4. MtDNA của động vật có
x
ƣ
ơng
sống và mtDNA gà
MtDNA là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, có chiều dài chừng 5µm.
Trong tế bào mtDNA chiếm từ 1 - 5% DNA của tế bào. MtDNA tự tái bản
theo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ DNA polimerase có trong chất nền ty thể và xảy
ra ở gian kỳ của chu kì tế bào. MtDNA có dạng vòng và không liên kết với
histon, điều này làm cho mtDNA khác với DNA của nhân tế bào và mtDNA
tƣơng tự với DNA của vi khuẩn. MtDNA là một trong các nhân tố qui định
tính di truyền tế bào chất.
Sự di truyền của các gen ty thể phụ thuộc vào hai yếu tố: Kiểu di truyền
của bản thân bào quan và số bản sao nhiễm sắc thể trong tế bào. Ở phần lớn
các loài, mỗi cá thể nhận