Nhập môn Công nghệ sinh học
31
Chương 2

Công nghệ DNA tái tổ hợp

I. Mở đầu
Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ
sự phát triển của các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các
quá trình sinh học ở mức độ phân tử. Từ đó, cho phép phân lập, phân tích và
thao tác trên các nucleic acid theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu
biết sâu sắc các lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chế
các loại thuốc mới, y học phân tử và liệu pháp gen.
Sự khám phá ra các enzyme hạn chế (restriction endonuclease) trong
những năm đầu 1970 là sự phát triển then chốt (key development) không chỉ
cho khả năng phân tích DNA hiệu quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắt
các phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới, một quá trình mà
ngày nay được gọi là tạo dòng gen (gene cloning). Phương thức tạo dòng
này đã báo hiệu một kỷ nguyên mới trong thao tác, phân tích và khai thác
các phân tử nucleic acid.
Tạo dòng gen đã cho ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấp
những hiểu biết giá trị trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động
của gen. Từ những ứng dụng đầu tiên của chúng, các phương pháp xây dựng
thư viện gen (gene library) được hình thành và phát triển, và hiện nay được
xem như là nền tảng cơ sở cho nhiều thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân
tử. Mặc dù phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) để
khuếch đại gen cho phép phân tích gen nhanh hơn nhưng trong nhiều trường
hợp kỹ thuật tạo dòng gen vẫn còn hữu ích và là một yêu cầu tuyệt đối.
Những phần dưới đây cung cấp một bức tranh tổng quát về các quá trình cơ
bản của công nghệ DNA tái tổ hợp.


- .
mRNA-cDNA (khi tổng hợp sợi th E.
coli
(đ
E. coli
5
.
- 1.
. Sợi đ
bacteriophage (cDNA library).

3. Phân lập đoạn DNA bằng phương pháp PCR
Ngoài hai phương pháp trên, hiện nay người ta sử dụng rất phổ biến
phương pháp PCR để phân lập một trình tự nucleotide (gen) từ genome của
Nhập môn Công nghệ sinh học
34
sinh vật dựa trên các primer đặc hiệu cho trình tự đó. Phương pháp PCR đơn
giản và ít tốn thời gian hơn hai phương pháp trên, mà hiệu quả vẫn rất cao.

các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích DNA).
AAAAAA 3’ mRNA
AAAAAA 3’ mRNA
TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ nhất

TTTTTT 5’

AAAAAA 3’
TTTTTT 5’
AAAAAA 3’
TTTTTT 5’ cDNA sợi đôi
Nuclease S1
DNA polymerase I
Tổng hợp sợi cDNA thứ hai
Biến tính nhiệt và xử lý
RNase H để phá hủy sợi
mRNA
Tổng hợp sợi cDNA thứ
nhất trên khuôn mẫu
mRNA
Reverse transcriptase
Gắn oligo(dT) primer
5’
5’
5’
3’
Đầu 3’ của cDNA tạo
thành vòng cặp tóc
5’
3’

g
DNA ban đầu có thể khuếch đại lên tới trên 1
PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95
o
C. Trong giai đoạn biến tính,
phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn
(single strands). Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị
dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó).
- Gắn primer (annealing) ở 40-65
o
C. Trong giai đoạn này các primer
gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị
lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo
thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi
đơn. Các liên kết ion ổn định hơ đoạn nhỏ (các primer đ
Nhập môn Công nghệ sinh học
36
) và trên các đ đôi đó (khuôn mẫu và primer)
enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.

Hình 2.2. Sơ đ phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

- Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72
o
C. Đây là khoảng nhiệt độ tối
thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có

protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của
enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa
(methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị
nhận biết bởi các enzyme hạn chế.
Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc trưng
chứa 4 hoặc 6 cặp nucleotide. Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E. coli cắt trình
tự GAATTC, enzyme TaqI của Thermus aquaticus cắt trình tự TCGA (Hình
2.3). Hiện nay, có trên 900 enzyme hạn chế khác nhau đã được tinh sạch từ
hơn 230 chủng vi khuẩn. Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử DNA sợi
đôi theo hai cách khác nhau như trình bày ở hình 2.3:

Pvu
II (
Proteus vulgaris
)
Eco
RI (
Escherichia coli
) (A1) (A2)
Rs
AI (
Rhodopseudomonas sphaeroides
)
Taq
I (
Thermus aquaticus
)

.
Trong thực tế, các đoạn DNA được gắn với nhau để tạo ra phân tử
DNA tái tổ hợp thường không phải là các đoạn ngẫu nhiên của DNA hệ gen,
mà thay vào đó là một trong các đoạn DNA mang một gen từ sinh vật
eukaryote hoặc vi khuẩn và một đoạn DNA khác thường là một phân tử
vector (vector molecule) hoạt động như là một vật truyền để chuyển gen
quan tâm vào trong một vi khuẩn hoặc một tế bào eukaryote. Hai loại vector
được sử dụng phổ biến nhất là một loại có nguồn gốc từ các plasmid của vi
Nhập môn Công nghệ sinh học
39
khuẩn và một loại khác có nguồn gốc virus xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn
(bacteriophage, viết tắt là phage).

2.1. Plasmid vector
1-
.
đặc đ
.
đư
i) hay multiple cloning sites (vùng
3-
:
- . 2.600 bp, mang gen
Amp
r
và gen lacZ’ lacZ’
.
N có ưu điểm k
lacZ’
.

SalI
1
lacZ’ ThrIleMetThr(Met)
400 420 440 460
Nhập môn Công nghệ sinh học
41

2.6. Plasmid vector pBluescript II SK (+/-). Vector này mang vùng tạo
dòng (multiple cloning sites-MCS) ở vị trí từ 598-826 trên gen lacZ’, và các vị trí
gắn primer khác nhau dùng cho phân tích trình tự đoạn DNA ngoại lai.

, DNA của plasmid được
in vitro
- (
của plasmid (ligation).
TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC…