Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------------------------------- NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

THÁI NGUYÊN- 2009
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng
nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học
Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình
làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng
Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình
giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm
khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã
tạo điều kiện cho tôi đi học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình
và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Thái Nguyên tháng 9 năm 2009
Học viên Nguyễn Văn Tuân
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS Ammonium persulphate
BSA Bovine serum albumin
CMC Carboxyl methyl cellulose
cs Cộng sự
DNA Deoxyribonucleic acid
DEAE Diethylaminoethyl
ĐC Đối chứng
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
IU International unit
kb Kilo base

1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa .............................................. 16
1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .................... 16
1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................................... 17
1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ...................... 20
1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM ...................... 22
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 25
2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ............................................................... 25
2.1.1 Chủng nấm .......................................................................................... 25
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 25
2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 26
2.1.4 Môi trƣờng .......................................................................................... 26
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.5 Dung dịch và đệm ................................................................................ 27
2.2 PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 28
2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................. 28
2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase ........................................................ 28
2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase ................................................................................................ 30
2.2.4 Tinh sạch enzyme ................................................................................ 32
2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 33
2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase ....................................... 34
2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 35
2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử ...................................................... 36
2.2.9 Xử lý số liệu ........................................................................................ 41
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 42
3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO ........................................................ 42
3.1.1 Tuyển chọn .......................................................................................... 42
3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA .............. 43

Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 79
Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian .......................... 79
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................... 80
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................... 80
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ................................................................ 50
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô ............................................................ 80
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen ............................................................. 52
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate .......................................... 81
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu ................................ 81
Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 ....... 81
Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE ............ 82
Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 57
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase ............. 82
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .......... 82
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .... 83
Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase ..................................................... 83
Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase ............................................................. 84
Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase ...................................... 85
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase............ 86
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại ................................................................ 66
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase ........ 86
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase ........................ 3
Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số
chủng vi sinh vật .................................................................................................... 8
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)
của Cel12A từ H. grisea ......................................................................................... 9

Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 60
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 61
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 62
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 63
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian ................................................................ 64
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 65
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 68
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1

1 MỞ ĐẦU
Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào
thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.
Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ
enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt
ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và
một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide.
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật
nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở
thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống
khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều

Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành
3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase)
(EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39].
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và
nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc
thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.
Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng
thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và
một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các
oligosaccharide). Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4

2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE
2.2.1 Nguồn gốc
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác
nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong
tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm
men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.
Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng

sinh trƣởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ,
kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quy trình
sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa,
enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác. Đối
với một số trƣờng hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn
enzyme.
Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trƣờng, thành phần
dinh dƣỡng nuôi chúng cũng nhƣ một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó
có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho
hàm lƣợng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, với
vi sinh vật, ngƣời ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên
các đối tƣợng khác để tăng lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp hoặc tổng hợp
định hƣớng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ
vi sinh vật, cần lƣu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có
biện pháp xử lý thích hợp.
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6

2.2.2 Phân loại
Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử
Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng
thủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1:
thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, 1992; http://afmb.cnrs-mrs.fr/ pedro/CAZY/db.html).
Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo
quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase đƣợc xếp
thành các nhóm khác nhau. Trƣớc đây, cellulase đƣợc chia làm hai nhóm:
nhóm enzyme C
1
và nhóm enzyme C

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
7

Các cellulase có nguồn gốc khác nhau đƣợc sắp xếp thành các họ.
Trƣớc đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase
đƣợc chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F [35]. Sau đó, cellulase đƣợc chia
thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31].
Hiện nay, các cellulase đƣợc sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45,
48, 61 và 74 [45].
2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
2.3.1 Cấu trúc bậc một
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối
lƣợng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi
polypeptide. Chủng A. oryzae KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại
endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid,
trọng lƣợng phân tử 31 kDa, đƣợc xếp vào họ cellulase H. Trong khi đó,
Cel B đƣợc xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid và
khối lƣợng phân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus
bao gồm 410 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các
endoglucanase từ chủng A. niger Z10 có khối lƣợng phân tử 83 kDa và
50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và
55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối lƣợng 35 kDa [56].
Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc
Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt
Humicola grisea. Cel12A của H. grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224
amino acid cấu tạo nên các chuỗi ,  và các vùng nối (Hình 1.2) [55].
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8


3
, A
5
-B
5
và A
6
-B
7
(Hình 1.3A) [55].
2.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H. grisea gồm 2 amino acid là
glutamic acid E-120 và E-205 (Hình 1.3B), còn ở Cel12A từ Trichoderma
reesei là E-116 và E-200 [55].

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác
(B) của Cel12A từ H. grisea [55]
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10

Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các
cellulase đƣợc thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain
(CBD). Các CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc
không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo
hóa học và cấu trúc không gian khác nhau. Cel12A của H. grisea có 3 vùng
liên kết với sự tham gia của các amino acid, trong đó cystein (C175, C206,
C216) đóng vai trò trung tâm. CBD1 với C175 làm trung tâm nằm trên
dải xoắn -A
6
liên kết yếu với các amino acid T85, I123, A144, F173, I177,

(B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12

2.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Các cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng đƣợc
ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp
thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất
dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt
trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh.
2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm
Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phƣơng
hƣớng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nƣớc quả và nƣớc uống không
cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thƣờng chứa các thành phần tế bào thịt quả và
các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu
đục. Glucanase thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các
polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách
chiết và làm trong. Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong
chế phẩm enzyme Viscozyme 120L đƣợc ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ
màng tế bào đậu tƣơng [14]. Trong quá trình sản xuất nƣớc cà rốt thƣờng sử
dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần
đƣờng, protein còn có một lƣợng không nhỏ các phân tử khối lƣợng cao nhƣ
cellulose và -glucan, làm ảnh hƣởng xấu đến quá trình lọc và chất lƣợng sản
phẩm. Ngƣời ta thƣờng sử dụng -glucanase để loại bỏ những thành phần
này. Các chế phẩm nhƣ Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger,
-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã đƣợc
sử dụng trong sản xuất bia.
Ngoài ra, endoglucanase còn đƣợc sử dụng trong công nghệ sản xuất
bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola

14

Trƣớc tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã đƣợc đƣa ra và một trong
những giải pháp đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức
ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học nhƣ sản xuất và bổ
sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm
enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và
hấp thụ chất dinh dƣỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trƣởng phát triển, nâng
cao chất lƣợng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn đƣợc
tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lƣợng vốn có, tiết kiệm chi phí
chăn nuôi, đồng thời làm giảm lƣợng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng
trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
Thức ăn gia súc, gia cầm đƣợc chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa
nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thƣờng không đƣợc tiêu hóa
triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu
các chất dinh dƣỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung
-glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên,
giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng
hấp thu và chuyển hóa thức ăn [14]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung
glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi
làm tăng đáng kể tốc độ tăng trƣởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi.
Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase
và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase)
xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng
tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme nhƣ sau:
khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác
tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% [52].
Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự
quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn