Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN HỮU QUÂN


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN HỮU QUÂN
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời
thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết
quả nhƣ ngày hôm nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quí báu đó !

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009
Học Viên
Nguyễn Hữu Quân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. ĐỊNH NGHĨA 2
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 2
1.2.1. Nguồn gốc 2
1.2.2. Phân loại enzyme 3
1.3. CẤU TRÚC 5
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất 5
1.3.2. Cấu trúc không gian 6
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC 8
1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae 10
1.6. Ứng dụng 11

tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27
2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 29
2.2.6. Điện di SDS-PAGE 30
2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 30
2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 32
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-
glucanase cao 36
3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S
rRNA 37
3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 39
3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 39
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 41
3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon 43
3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen 44
3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen 45
3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy 46
3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy 47
3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 48
3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 50
3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 50
3.5.2. pH phản ứng tối ƣu 51
3.5.3. Độ bền nhiệt 52
3.5.4. Độ bền pH 54
3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ 55
3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa 56
3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại 57

Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 71
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β-
1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 73
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 73
Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 74
Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase 75
Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase 76
Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 77
Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 77
Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của

Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) 49
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 51
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở
chủng A. oryzae VTCC-F-045 52
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 53
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A.
oryzae VTCC-F-045 54
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 55
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 56
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
g
Microgram
l
Microliter
APS
Ammonium persulphate
Cel
Cellulose
CMC
Carboxyl methyl cellulase
cs
Cộng sự
EDTA

Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc
nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một
cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và
một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân
giải mạnh mẽ cellulose vô định hình.
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau
nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt
ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên,
nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức
đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma
viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus).
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác
nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực
phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung
môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh.
Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi
sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ
phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài:
Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó
Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4-
glucanase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐỊNH NGHĨA
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase.
Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân

A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng
Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and
Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc
chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá,
2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao.
1.2.2. Phân loại enzyme
1.2.2.1. Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng
enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside
bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng
tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et
al., 2008).
Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi là
endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC
3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng
2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello
dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside
glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong
phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau.
Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi
cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose
(cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002).
1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ
khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể.

Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm

(hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm
hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002).
1.3. CẤU TRÚC
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần
cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có
khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng
A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng
Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A. terreus
M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008).
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất
Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase
thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng
44 kDa và đƣợc gọi là ThEG. ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi
polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6
chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ
chủng A. niger (49%).
Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân
tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là
CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã
hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa
1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino
acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và
CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa.
Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có
những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12
(GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo
nên các chuỗi α, β và các vùng nối.
1.3.2. Cấu trúc không gian Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A)
và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. Grisea (Sang et al., 2003)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8
Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC
Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose
tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy
phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme
trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy
phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau.
Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan
của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9
này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải
phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3). Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A)
và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002)
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo-β-1,4-

Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. Oryzae (Machida et al., 2005)

1.6. Ứng dụng
Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase đƣợc
ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhƣ công nghiệp
sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản
xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công
nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh.
1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên
liệu ban đầu chứa hàm lƣợng cao các chất khó tan là lignin và một phần
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12
hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột
mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung
endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng
nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học.
Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các
enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất
vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc khi
sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã đƣợc
dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn
trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004).
1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa
trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt
đƣợc nghiền, thu đƣợc thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả
nghiền đã ép bã thu đƣợc dịch quả. Dịch này thƣờng chứa các thành phần tế

ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dƣỡng cung
cấp năng lƣợng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó,
các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4
glucoside. Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột
hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn
trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dƣỡng nhƣ protein, tinh bột
và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
14
dƣỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả
năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.
Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu
cellulose nhƣ rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang đƣợc triển khai ở
nhiều nƣớc, trong mọi lĩnh vực nhƣ sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho
gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thƣờng đƣợc sử dụng lên men các nguồn
phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lƣợng các amino acid
cân đối, các vitamin và tạo hƣơng thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi (Đặng
Thị Thu et al., 2004, Vũ Duy Giảng, 2009).
1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et
al., 2004).
1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trƣờng dẫn tới mất cân
bằng sinh thái và phá hủy môi trƣờng sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống
con ngƣời. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử
dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu