Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN HỮU QUÂN
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN HỮU QUÂN
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời
thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết
quả nhƣ ngày hôm nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quí báu đó !
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009
Học Viên
Nguyễn Hữu Quân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2
1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2
1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2
1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3
1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5
1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8
1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10
1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11
tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27
2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29
2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30
2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30
2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36
3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-
glucanase cao ............................................................................................... 36
3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S
rRNA............................................................................................................ 37
3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39
3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41
3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43
3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44
3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45
3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46
3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47
3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48
3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50
3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50
3.5.2. pH phản ứng tối ƣu ............................................................................. 51
3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52
3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54
3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55
3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56
3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β-
1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73
Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74
Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75
Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76
Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77
Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77
Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của
Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A.
oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
g
Microgram
l
Microliter
APS Ammonium persulphate
Cel Cellulose
CMC Carboxyl methyl cellulase
cs Cộng sự
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
kb Kilobase
kDa Kilo Dalton
M Marker (thang protein chuẩn)
MTK Môi trƣờng khoáng
Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó
Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4-
glucanase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐỊNH NGHĨA
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase.
Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân
tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để
giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện
hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình.
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI
1.2.1. Nguồn gốc
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau
nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc
nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi,
nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme
chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần trong năm và chủ động
sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng nhƣ dễ dàng điều khiển có
định hƣớng nguồn enzyme hoặc gia tăng lƣợng enzyme. Ngày nay, cùng với
sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phƣơng
pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi
bật mà các đối tƣợng động vật, thực vật ít áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo.
Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một
số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.
Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh endo-β-1,4-
4
hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside
glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong
phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau.
Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi
cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose
(cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002).
1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ
khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể.
Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm
enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3.
Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng
là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự
do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1
giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có
độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình
tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase
CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và
Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối
lƣợng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của
Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002).
Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase
(CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều
thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu
trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid
giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5
Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân
tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là
CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã
hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa
1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino
acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và
CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa.
Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có
những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12
(GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo
nên các chuỗi α, β và các vùng nối.
1.3.2. Cấu trúc không gian
Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β
là A và B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β
(B1-B9). Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm
của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề
mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và
205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống
nhƣ gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ. Các dải
xoắn β đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ
29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β:
B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175,
C206 và C216 đƣợc định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
7
trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên
(Hình 1.1).
Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở
bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến
β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực
của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9
này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải
phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3). Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A)
và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002)
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo-β-1,4-
glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu
endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose
và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn
cellobiose. Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và
glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10
Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase
1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae
A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002).
Bào tử của A. oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin.
A. oryzae tiết ra môi trƣờng các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase,
xylanase và hemicellulase khi sống trên môi trƣờng có nguồn cơ chất tƣơng
ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose. Nên A. oryzae đã đƣợc ứng
dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công
nghiệp sản xuất các enzyme. Ở Nhật Bản A. oryzae đƣợc sử dụng trong quá
vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc khi
sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã đƣợc
dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn
trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004).
1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa
trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt
đƣợc nghiền, thu đƣợc thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả
nghiền đã ép bã thu đƣợc dịch quả. Dịch này thƣờng chứa các thành phần tế
bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ
nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm
quan nƣớc quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất
quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết
hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá
trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase,
hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của
nƣớc quả có thịt sẽ tốt hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease
và glucanase đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13
giảm lƣợng diacetyl đƣợc tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia.
Trong dịch lên men có chứa một lƣợng β-glucan, chất này ảnh hƣởng tới khả
năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004).
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu đƣợc sản
xuất bằng phƣơng pháp khô, phƣơng pháp này cho chất lƣợng cà phê không
cao. Để tiến hành nâng cao chất lƣợng cà phê, phƣơng pháp lên men đã đƣợc
áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử
lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ,
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et
al., 2004).
1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trƣờng dẫn tới mất cân
bằng sinh thái và phá hủy môi trƣờng sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống
con ngƣời. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử
dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu
quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do
các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải.
Sau khi nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa
nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải (Lý Kim Bảng et al., 1999) đã tuyển chọn đƣợc
3 chủng xạ khuẩn, 4 chủng vi khuẩn ƣa nhiệt trong bể rác thải có khả năng
Copyright: Tài liệu đại học ©