i




***000***




PROTEIN MBP- : 
: 2001-2005
  
 TR Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005 iii

Con t
.
Ch 
-  
ch 
-         


TÓM TẮT

TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-
VT2eB TRÊN HEO”

Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. Nguyễn Ngọc Hải
Sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB pha trong keo phèn
với liều 50µg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại gây đáp ứng miễn dịch trên
heo. Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên trên 25 cá thể với 5 lô thí nghiệm. Sau đó thu
kháng huyết thanh để định hiệu giá kháng thể theo 2 phƣơng pháp: trung hòa độc tố
trên tế bào vero và khuyếch tán kết tủa trên thạch.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều 50µg và 75µg/heo pha trong keo phèn là
loại kháng nguyên an toàn với heo.
- Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa
khuyếch tán trên thạch.
- Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp trung
hòa độc tố trên tế bào vero: huyết thanh phải bất hoạt trƣớc khi thử nghiệm và
không bổ sung sodium azid vào trong huyết thanh.
- Liều tiêm 50µg và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không tạo đủ lƣợng
kháng thể để phát hiện bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch và
trung hòa độc tố trên tế bào vero.
2.1.3.1 Vacxin sống .............................................................................. 9
2.1.2.2 Vacxin vô hoạt ....................................................................... 10
2.1.2.3 Vacxin phân tử ....................................................................... 10
2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e .............................................................. 12
2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB .................................................... 14
2.3 PHƢƠNG PHÁP OUCHTERLONY .................................................................. 14
2.3.1 Nguyên tắc .................................................................................................. 14
2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên
thạch ...................................................................................................................... 16
vi
2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO
VERO .............................................................................................................. 16
2.4.1 Sơ lƣợc về tế bào Vero ...................................................................... 16
2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố .............................................. 17
2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phƣơng pháp trung hoà độc
tố verotoxin trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero ...................................... 17
3.  ........................................ 18
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .................................................................... 18
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 18
3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ........................................................................ 18
3.3.1 Sinh vật thí nghiệm ............................................................................ 18
3.3.2 Hóa chất thí nghiệm ........................................................................... 18
3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm ............................................................................ 19
3.4 PHƢƠNG PHÁP ...................................................................................... 20

4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt .................... 30
4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt ................... 31
4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero .............. 33
4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid ........................................... 33
4.4.3.1 Đối với mẫu không có sodium azid ....................................... 33
4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt ........ 33
5. ............................................................................. 36
5.1 KẾT LUẬN ............................................................................................... 36
5.2 ĐỀ NGHỊ .................................................................................................. 36
6. ............................................................................... 38
 ......................................................................................................... 39
Thành phần hóa chất ............................................................................................. 39
Bảng phân tích biến lƣợng tăng trọng heo thí nghiệm ......................................... 41
Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid, có bất hoạt ............ 42
Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid, có bất hoạt 43


ix


1


1.1 
Độc tố verotoxin VT2e do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây bệnh phù trên
heo sau cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở nƣớc ta.
Việc sử dụng kháng sinh để điều trị phù ở heo tuy có hiệu quả nhƣng gây ra
nhiều triệu chứng phụ nhƣ rối loạn tiêu hoá, tạo ra các chủng vi sinh vật kháng kháng
sinh gây khó khăn cho những lần trị bệnh về sau. Do đó sử dụng vacxin để phòng bệnh
phù do E. coli trên heo đƣợc xem là liệu pháp thích hợp nhất. Một số tác giả đã thử
nghiệm vacxin nhƣợc độc, hoặc vacxin chết ...bƣớc đầu ghi nhận hiệu quả bảo vệ nhất
định. Tuy vậy, các phản ứng phụ vẫn là những trở ngại lớn cho việc áp dụng rộng rãi
những loại vacxin này. Vacxin tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách loại bỏ yếu tố gây
bệnh của vi sinh vật mà vẫn giữ đƣợc đặc tính kháng nguyên của chúng đang đƣợc các
nhà khoa học quan tâm nhằm khắc phục những nhƣợc điểm nói trên.
Hiện nay, TS. Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra
đƣợc E. coli mang gen mã hoá cho tiểu phần B của độc tố VT2e và tinh sạch đƣợc
protein này. Từ thực tế đó, đƣợc sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với
sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “
-”.
1.2 
- Mục tiêu
Đánh giá khả năng ứng dụng protein tái tổ hợp MPB-VT2e trong sản xuất vacxin
phòng bệnh phù do E. coli trên heo.
- Yêu cầu
 Xây đựng thí nghiệm kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của MBP-VT2eB
trên heo.

móng, bệnh tả...với nhiều dạng tồn tại khác nhau. Nhƣng dù bất cứ dạng nào vacxin
cũng mang một chức năng chung là tạo miễn dịch cho cơ thể ngƣời và động vật, phòng
chống lại các loại bệnh truyền nhiễm và nhiều tác nhân gây hại khác [4].

2.1.2.1 Kháng nguyên[4]
a. Định nghĩa
Kháng nguyên là một chất tự nhiên hay tổng hợp có khả năng gây đáp ứng miễn
dịch khi đƣợc đƣa vào cơ thể của một động vật thích hợp hoặc là chất có khả năng
phản ứng với một kháng thể hay một tế bào của hệ thống miễn dịch. Trên cấu trúc
phân tử của kháng nguyên có sự hiện diện của các quyết định kháng nguyên gọi là
epitope.
b. Tính chất của kháng nguyên
 Tính sinh miễn dịch: tính sinh miễn dịch của một kháng nguyên phụ thuộc
vào: 3
3
Trọng lƣợng phân tử : kháng nguyên phải có trọng lƣợng phân tử đạt tối
thiểu là 10.000Da. Tuy nhiên có một số chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ nhƣng
có tính sinh miễn dịch vì chúng gắn với protein khác để trở thành kháng nguyên
hoàn chỉnh, ngƣợc lại một số chất có trọng lƣợng phân tử lớn nhƣng không có
tính sinh miễn dịch.
Lƣợng epitope khác loài vì hệ thống miễn dịch không phản ứng với các
epitope cùng loài.
 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của kháng nguyên do những epitope quyết định. Các

4
4
thể khác và ngay trong một cá thể, phần này đƣợc kí hiệu V
κ
(cho type
kappa) và V
λ
(cho type lambda). [3]
Có các kiểu chuỗi nặng nhƣ: µ, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, α, ε và dạng của chuỗi nặng sẽ
qui định phân loại lớp nhƣ IgM, IgD, IgG, IgA, và IgE và dƣới lớp nhƣ IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 (5) . Các chuỗi nặng đƣợc cấu tạo từ hai vùng:
vùng hằng định (CH) và vùng dễ biến đổi (VH), các vùng dễ biến đổi có khu vực
tận cùng là N. Các vùng dễ biến đổi bao gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable)
đƣợc tách biệt bằng các vùng bảo thủ hơn (framework regions) ở giữa. Những
vùng này là những vùng liên kết với kháng nguyên hay còn gọi là paratop, vì vậy
nó còn đƣợc gọi là vùng định tính bổ sung (complementarity-detemining regions)
[15]. Vùng nằm giữa CH1 và CH2 của chuỗi H đựơc gọi là vùng khớp hay vùng
bản lề đảm bảo cho tính mềm dẻo của các phân tử kháng thể đồng thời là hai
cánh tay (VL, CL, VH, CH1) di động trong không gian.
2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch
Khi cơ thể đã đƣợc miễn dịch thì khi tác nhân gây bệnh xâm nhập, chúng
sẽ không thực hiện đựơc quá trình gây bệnh và nhanh chóng bị loại trừ khỏi cơ
thể. Nhƣ vậy vacxin là yếu tố khởi phát của quá trình đáp ứng miễn dịch và kháng
nguyên là thành phần cơ bản của vacxin. Khi đƣa vacxin vào cơ thể cũng có nghĩa

Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể do tế bào lymphô B đảm nhận. Từ tế
bào nguồn tủy xƣơng biệt hóa thành tế bào lympho B khởi thủy (pro-B) sau đó
thành tiền lymphoB (pre- B). Tiếp theo các tế bào này sẽ đƣợc biệt hoá thành
lympho B chƣa chín có bộc lộ bề mặt IgM. Sau đó lympho B chín muồi đã bộc lộ
IgM và IgD bề mặt. Nếu lympho B chín không gặp kháng nguyên sẽ bị phân hủy.
Lympho B khi gặp kháng nguyên và đƣợc sự hợp tác hổ trợ của lympho T giúp
(helper T for B cell) hoặc hợp tác giúp đỡ của lympho T hổ trợ sẽ tiếp tục đƣợc
biệt hóa thành nguyên bào (B-blast) và tế bào plasma (plastmocyte). Chỉ có tế bào
plasma mới có khả năng tiết kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên lạ. Các kháng
thể này đi vào máu và tồn tại trong huyết thanh hoặc chất dịch của cơ thể. Mặt
khác nguyên bào B sẽ trở thành tế bào B ghi nhớ (memory- B) để khi gặp kháng
nguyên vào nhắc nhở, chúng có thể nhanh chóng nhớ lại và sản xuất kháng thể
nhanh và nhiều hơn [5] . 6
6
Miễn dịch trung gian tế bào do tế bào lympho T đảm nhận. Các tế bào
nguồn bắt đầu từ tủy xƣơng di tản xuống tuyến ức và đƣợc tuyến ức huấn luyện,
biệt hóa rồi non hóa trở lại để trở thành tiền lympho T. Các tiền lympho T tiếp tục
đƣợc biệt hóa thành ở vùng vỏ tuyến ức để trở thành lympho T chƣa chín. Các
lympho T chƣa chín đƣợc biệt hóa tiếp tục để trở thành lympho T chín đi vào hệ
máu ngoại vi và đi đến các cơ quan tổ chức khác cƣ ngụ tại các vùng phụ thuộc
tuyến ức của lách và hạch. Khi đại thực bào đƣa thông tin kháng nguyên đến các
lympho T tiếp nhận, rồi biệt hóa để trở thành nguyên bào lympho T rồi tiếp tục trở
thành nhóm tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chức năng nhƣ một kháng thể
đặc hiệu. Nhƣ vậy kháng thể tế bào là loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch

Khả năng phòng hộ của vacxin phụ thuộc vào yếu tố quyết định tính miễn
dịch của chế phẩm. Yếu tố này chính là thành phần protein đặc biệt có trên bề mặt 7
7
của tác nhân gây bệnh hay trên bề mặt của chế phẩm vacxin của chính tác nhân
gây bệnh đó. Thành phần này còn đƣợc gọi là kháng nguyên do một gen hay một
số gen của vi sinh vật tổng hợp nên. Những gen này đƣợc gọi là gen kháng
nguyên. Ngƣời ta có thể clone gen này và chuyển vào một hệ thống vectơ thích
hợp để sản xuất ra loại protein của gen kháng nguyên làm vacxin. Protein này còn
đƣợc gọi là protein tái tổ hợp dùng sản xuất vacxin tái tổ hợp [3].
2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch [4]
Bản thân túc chủ
Những loài khác nhau thì khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau. Ở những
cá thể khác nhau thì tính sinh miễn dịch cũng khác nhau, do:
 Di truyền: ngƣời ta có thể tăng khả năng đáp ứng miễn dịch bằng cách
tuyển chọn những nhóm giống có khả năng đáp ứng miễn dịch cao. Tùy cơ địa
của từng cá thể mà có thể có hiện tƣợng dị ứng khi gây miễn dịch.
 Tuổi: thú quá nhỏ thì khả năng đáp ứng miễn dịch không cao do hệ
thống cơ quan miễn dịch của thú chƣa phát triển hoàn chỉnh. Hơn nữa những thú
nhỏ đều có kháng thể do mẹ truyền nên những kháng thể này có thể trung hòa
kháng nguyên đƣa vào.
 Tình trạng sức khỏe: những thú khỏe mạnh khả năng đáp ứng miễn dịch
cao hơn những thú bị bệnh hay sức khỏe yếu. Do đó chỉ gây miễn dịch với những
thú có sức khỏe tốt , không mắc các bệnh truyền nhiễm khác.
 Chế độ dinh dƣỡng: những thú đƣợc nuôi dƣỡng tốt sẽ đáp ứng miễn

kích ứng miễn dịch thấp.
Cách gây miễn dịch và liều lƣợng kháng nguyên
 Đƣờng đƣa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: Với những kháng nguyên
mạnh, đƣa kháng nguyên vào đƣờng mạch máu có thể dễ dàng gây đáp ứng miễn
dịch: nhƣ vi khuẩn, virus, tế bào. Những kháng nguyên hòa tan thì phải có quy
trình gây miễn dịch thích hợp tốt nhất là đƣờng tiêm trong da, dƣới da.
 Liều lƣợng kháng nguyên: nếu lƣợng kháng nguyên quá thấp thì không
đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây
ức chế miễn dịch.
 Quy trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn tới tính sinh miễn dịch của
phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên nếu gây miễn dịch trên hai
qui trình khác nhau thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch khác nhau. Mỗi một loại
kháng nguyên thích hợp với một qui trình gây miễn dịch riêng. Đối với những
kháng nguyên yếu thì phải tuân theo một qui trình miễn dịch nghiêm ngặt và phải
chủng nhiều lần mới có hiệu quả. Trong khi đó những kháng nguyên mạnh thì chỉ
cần chủng một lần.
Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
 Các nhà miễn dịch học đã chứng minh rằng: nếu gây miễn dịch nhiều
loại kháng nguyên cùng lúc cho thú thì lƣợng kháng thể đặc hiệu sinh ra tƣơng 9
9
ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hay nhiều hơn khi kháng
nguyên đó kích thích một mình. Đây là hiện tƣợng cộng lực kháng nguyên. Tuy
nhiên đối với những kháng nguyên có cấu trúc hóa học gần giống nhau thì xảy ra
hiện tƣợng cạnh tranh kháng nguyên. Nếu cùng một lúc mẫn cảm hai loại kháng

10
trƣờng không thích hợp, các vi sinh vật này sẽ thích nghi dần dần và trở thành
không độc. Vì vi sinh vật vẫn còn sống và có khả năng sinh sản trong cơ thể kí
chủ nên nó kích thích các tế bào nhớ sản xuất kháng thể liên tục. Tuy nhiên, số
lƣợng vi sinh vật phát triển trong cơ thể kí chủ khó có thể kiểm soát và trong một
số trƣờng hợp các vi sinh vật có thể phục hồi gây bệnh. Vacxin này không nên
dùng cho những con thú bị suy giảm miễn dịch. Hiện nay, ngƣời ta dùng một số
phƣơng pháp công nghệ sinh học để loại bỏ gene gây bệnh để tạo ra vacxin an
toàn hơn.
2.1.2.2 Vacxin vô hoạt (inactivated vaccine)
Tác nhân gây bệnh sẽ bị giết hay bất hoạt bằng phóng xạ, formalin, nhiệt
độ...không còn khả năng nhân lên trong vật chủ nhƣng vẫn đảm bảo đặc tính
kháng nguyên của chúng. Vacxin này an toàn hơn so với vacxin sống, dễ sản xuất
và sử dụng. Tuy nhiên nó không có khả năng hoặc nếu có thì rất ít kích thích tế
bào T gây độc và phải sử dụng lập lại nhiều lần.
2.1.2.3 Vacxin phân tử
a. Vacxin kết hợp (conjugate vaccine)[10]
Ngƣời ta chỉ sử dụng những phần của tác nhân gây bệnh có khả năng tạo ra
đáp ứng miễn dịch nhƣ protein hay carbonhydrate. Các vi sinh vật gây bệnh sẽ bị
phá vỡ từng phần và các thành phần sẽ đƣợc tinh sạch. Ngƣời ta chỉ sử dụng một
vài thành phần để tiêm. Bằng cách này ngƣời ta sẽ tránh đƣợc những nguy cơ tiềm
ẩn của độc tố và những thành phần che khuất kháng nguyên ảnh hƣởng đến khả
năng đáp ứng miễn dịch bị loại bỏ. Tính chất kháng nguyên của các thành phần
này phải đƣợc kiểm tra khả năng tạo đáp ứng miễn dịch chính xác và hiệu quả.
Dựa trên hiện tƣợng một số vi khuẩn bị đột biến mất vỏ thì không có khả
năng gây bệnh, ngƣời ta đã dùng vỏ polysaccharide nhƣ một kháng nguyên để làm
vacxin. Tuy nhiên polysaccharide là những kháng nguyên độc lập với tế bào T (T-

mã hóa cho những protein “không cần thiết”. Do đó có thể làm giảm tính độc của
vi sinh vật.
c.Vacxin peptide tổng hợp [17]
Hƣớng sản xuất vacxin này phát triển nhanh nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật tạo
dòng và giải trình tự của DNA. Ngƣời ta nghiên cứu các cấu trúc không gian và
trình tự của các epitope của kháng nguyên đƣợc nhận biết bởi tế bào B và tế bào
T. Nhóm này có thành phần vào khoảng 8-12 axit amin. Sau khi đƣợc tổng hợp
các axit amin này phải đƣợc gắn vào giá đỡ, thƣờng là các hạt polyme có khả
năng hấp phụ cao và sử dụng chung với các loại chất bổ trợ tốt. Ƣu điểm của loại
vacxin này là an toàn, ổn định, dễ bảo quản và vận chuyển. Tuy nhiên việc sản
xuất vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao.
d.Vacxin DNA [17]
Khi đƣa DNA của một loại plasmid vectơ có chứa gen kháng nguyên vào cơ
thể thì thấy có hiện tƣợng gen kháng nguyên đó tổng hợp ra protein kháng nguyên 12
12
và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein do gen kháng nguyên kích
thích sinh ra. Dựa trên hiện tƣợng này, ngƣời ta tạo ra vacxin DNA bằng cách tái
tổ hợp gen kháng nguyên của một plasmid vectơ với một hệ thống promotor
mạnh. Loại kháng nguyên này sẽ kích hoạt tiết interleukin 12. Interleukin này sẽ
tác động vào những tế bào chết tự nhiên gây phân tiết interferon-g kích thích sự
phát triển của tế bào trợ giúp T. Vacxin này có ƣu thế lớn với phƣơng thức gây
miễn dịch đơn giản, bền với nhiệt độ do chỉ chứa DNA thuần khiết.Vacxin DNA
an toàn đối với những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Tuy nhiên việc đƣa một
DNA lạ vào cơ thể đôi khi gặp nguy hiểm do sự nhạy cảm của tế bào miễn dịch

VT2e hay còn gọi là SLT-IIv là nhóm độc tố vero, đƣợc Konowalchuk và cộng
sự đặt tên đầu tiên năm 1977. Độc tố này chung họ với nhóm của Shigella và có đặc
trƣng gây độc trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney)
hơn là trên tế bào Hela, do đó còn đƣợc gọi là độc tố VT2e. Độc tố VT2e bị trung hòa
một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I.
VT2e đƣợc cấu tạo từ hai thành phần: một đơn vị A nặng 32kDa và năm đơn vị B
(7.7kDa/ đơn vị). Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase. Enzyme này
sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA. Sự phân cắt này sẽ
làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (elongation factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với
tiểu phần 60S của RNA ribosome. Do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế
bào. Những tiểu phần B chịu trách nhiệm cho khả năng kết dính những thụ thể bản
chất glycolipid có sẵn trên bề mặt của tế bào ruột cũng nhƣ trên các tế bào vero. Các
độc tố SLT-I và SLT-II chỉ liên kết với Gal 1-4Gal -4Glc 1-1Cer (globotriosyl
ceramid- Gb3), trong khi độc tố VT2e liên kết với cả Gb3 và GalNAc 1-3Gal 1-
4Gal 1-4Glc 1-Cer (globotetraosyl ceramid-Gb4), Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 11-
4Gal 1-aGlc 1-1Cer (globopenosyl- Gb5) trên tế bào vero [13]. Các tế bào của lớp
nội mô ở heo nhạy cảm với độc tố VT2e. Và độc tố này gây ra những tổn thƣơng chủ
yếu trên lớp nội mô của mạch máu, làm biến đổi khả năng thấm của mạch máu và hậu
quả gây nên chứng phù .
Năm 1988, trình tự của một operon mã hóa cho độc tố VT2e đã đựơc báo cáo.
Trình tự axit amin của tiểu đơn vị A của VT2e dài hơn một axit amin và tƣơng đồng
94% so với SLT-II. Trong khi tiểu đơn vị B của VT2e ngắn hơn hai axit amin, và
tƣơng đồng 87% với SLT-II [7].
Việc phòng bệnh phù nhờ vacxin dựa vào độc tố VT2e cũng đã đƣợc nghiên
cứu. MacLeod và Gyles đã chứng minh đƣợc khả năng bảo vệ heo con bằng cách tiêm
tĩnh mạch độc tố VT2e bị vô hoạt bởi glutaraldehyde. Gordon và cộng sự đã phát hiện
độc tố VT2e sau khi xử lý với formaldehyde có thể tạo miễn dịch trên heo con [9]. Tuy
nhiên cách này có thể gây tồn dƣ độc tố in vivo. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng một
kháng nguyên từ độc tố VT2e đã bị thay đổi một axit amin (Glu167-->Gln) trên vùng
hoạt động của tiểu đơn vị A. Việc miễn dịch này có thể bảo hộ cho heo con khỏi bệnh

dƣới sự kiểm soát của gen khởi động ptac. Gen này đƣợc hoạt hóa bởi IPTG. Do đó
khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ kích ứng sự tổng hợp protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
Protein này sẽ đƣợc tinh sạch bằng cách cho qua các cột sắc ký mang hạt
amylose. Protein mục tiêu có ái lực với amylose sẽ đƣợc giữ lại. Sau đó, tiếp tục cho
dung dịch đệm maltose chạy qua cột sắc ký sẽ thu đƣợc protein này.
2.4 ERLONY
Phƣơng pháp Ouchterlony hay còn gọi là phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch
đƣợc Orjan Ouchterlony phát hiện năm 1948.

Phƣơng pháp này dựa trên hai nguyên tắc: 15
15
Cấu trúc phân tử của agar
Cấu trúc phân tử đặc trƣng của agar hay agarose cho phép các phân tử có
trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn 200 kDa khuyếch tán dễ dàng qua các khoảng
trống giữa chúng. Nhờ vậy mà các phân tử kháng nguyên hay kháng thể có thể
khuyếch tán qua gel tùy theo nồng độ ban đầu và bán kính Stoke, trong khi đó
những phân tử ở dạng kết hợp có kích thƣớc lớn sẽ không thể di chuyển.
Liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể
Kháng nguyên liên kết với epitop kháng thể thông qua vị trí paratop theo
nguyên tắc bổ sung không gian tƣơng tự liên kết giữa “ổ khóa- chìa khóa”. Sự
liên kết đƣợc thiết lập và duy trì là nhờ các lực hấp dẫn có năng lƣợng nhỏ nhƣ:
 Lực tĩnh điện giữa các nhóm COO
-
và NH
16
16
-  

Các thử nghiệm này đƣợc thực hiện bằng cách cho kháng nguyên hay kháng thể
vào các giếng nhỏ đƣợc cắt trên agar hay agarose. Dung dịch kháng nguyên hay kháng
thể chuẩn đƣợc cho vào các giếng trung tâm, kháng thể hay kháng nguyên cần tìm sẽ
đƣợc cho vào các giếng xung quanh. Chúng sẽ khuyếch tán trong thạch. Nếu chúng
gặp nhau ở cùng một tỉ lệ tƣơng đƣơng thì sẽ tạo nên một vạch có thể quan sát bằng
mắt thƣờng.
TOXIN TRN 

Dòng tế bào biểu mô vero nhạy cảm với độc tố SLT đƣợc Y. Yasumura và Y.