1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, nƣớc ta có nhiều nhà máy đƣờng tạo ra một sản lƣợng lớn về đƣờng
kết tinh. Bên cạnh đó một lƣợng không nhỏ mật rỉ đƣờng mà các nhà máy này thải ra
làm ô nhiễm môi trƣờng. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những
phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị nhƣ L-lysine, acid citric,
acid glutamic.v.v. và đặc biệt là acid lactic đƣợc quan tâm nhiều trong những năm gần
đây.
Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày càng nhiều, bởi vì chúng đƣợc ứng dụng rộng
rãi trên nhiều lĩnh vực nhƣ bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trƣờng
(acid polylactic thay thế các loại sản phẩm nhựa PE, PP, đĩa CD, bịch nilon), mỹ
phẩm.v.v.
Tổng thị trƣờng thế giới về acid lactic 86.000 tấn vào năm 2001, 500.000 tấn vào
năm 2010. Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dƣợc IIdong (Hàn Quốc) xuất
khẩu một số lƣợng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dƣợc ở Việt
Nam với giá trị hợp đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40].
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đƣợc sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh
học trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. Dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Nguyễn Đức
Lƣợng trƣờng Đại học Bách Khoa và Thầy Phan Vĩnh Hƣng Trƣờng Cao đẳng Công
nghiệp Thực Phẩm TP.HCM. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình lên
men lactic từ mật rỉ đường”.
1.2. Mục đích của đề tài

Loại L - acid lactic ở dạng tinh thể. Chúng có khả năng tan trong nƣớc, tan trong
cồn, tan trong eter, không tan trong CHCl
3
, nhiệt độ nóng chảy 28
o
C [9]. L - acid
lactic đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Hầu hết các sinh
vật lên men lactic đồng hình đều tạo ra đƣợc các dạng đồng phân quang học [32].
Loại D - acid lactic là dạng tinh thể, tan trong nƣớc tan trong cồn. Nhiệt độ nóng
chảy 28
o
C.
Nếu D - acid lactic và L - acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 ngƣời
ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có
tỉ lệ lý tƣởng này mà chỉ có đƣợc hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL -
acid lactic có khả năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl
3
[9].
2.2. Vi sinh vật trong lên men lactic
Vi khuẩn lactic có thể đƣợc phân lập từ các cây trồng trên thế giới bao gồm hạt
trái cây và rau [24]. Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột non, ruột già và
âm đạo [21].
3

4

Bảng 2.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler và Weiss, 1986)
Đặc đểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III
Lên men pentose
Tạo CO
2
từ glucose
Tạo CO
2
từ gluconate
Sự hiện diện FDP aldolase
Sự hiện diện phosphoketolase
-
-
-
+
-
+
-
+
a

lactic và lên men lactic dị hình thì glucose lên men tạo thành acid lactic, ethanol, acid
acetic và CO
2
. Thật ra việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose sẽ phân biệt đƣợc giữa
hai nhóm này (Sharpe, 1979).
2.2.1. Vi khuẩn lactic dị hình
Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng, các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng
tạo ra lƣợng acid lactic không lớn lắm. Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt
các sản phẩm khác nhƣ acid acetic, ethanol, CO
2
[3], [9].
Một số loài vi khuẩn lactic dị hình đƣợc nghiên cứu nhƣ sau:
- Lactobacillus pasteurianus
Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc rộng 0,5 – 1 μm; dài 7,0 – 35 μm. Trong
thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ, không di động. Có khả năng lên men đƣợc, glucose,
fructose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin. Trong quá trình lên men
5

tạo một số sản phẩm nhƣ CO
2
, alcohol, acid lactic, acid acetic. Nhiệt độ thích hợp 29 -
33
o
C, pH thích hợp 8 [9].

có khả năng lên men đƣợc glycerol, sorbitol .
- Streptococcus faecalis
Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 37
o
C, nhiệt
độ sinh trƣởng 10 - 45
o
C, có thể phát triển duới hoặc 5
o
C, hiếm khi phát triển ở 50
o
C.
Có khả năng sống sót ở 62,8
o
C trong 30 phút. Phát triển ở pH 9,6. Chịu đƣợc nồng độ
NaCl 2 %, 4 % và 6,5 %. Có khả năng lên men đƣờng glucose, maltose, lactose và
luôn luôn lên men mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol
[18].

6

2.2.2. Vi khuẩn lactic đồng hình
Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng thì vi khuẩn lactic đồng hình thƣờng
tạo ra acid lactic là chủ yếu [3], [9].

o
C. Tối thiểu 22
o
C [20]. Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thƣờng đƣợc chọn
để lên men Whey để tạo acid lactic, sau đó dùng Ca(OH)
2
để trung hòa lƣợng acid
lactic tạo thành. Nhiệt độ lên men 43
o
C, với nhiệt độ này đủ để ức chế các vi sinh vật
gây nhiễm mà không ức chế L. bulgaricus [22].
- Lactobacillus bifidus
Trực khuẩn rất nhỏ, kích thƣớc trung bình khoảng 4 μm, không có khả năng di
động, thuộc gram dƣơng. Chúng có thể đứng riêng lẽ, cặp và chuỗi ngắn. Có khả năng
7

lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, saccharose, dextrin, tinh
bột và maltose [18].
- Lactobacillus casei
Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sữa, sản phẩm của sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng
trong chăn nuôi, vi khuẩn dạng hình que, kích thƣớc 0,7 - 1,1 μm; 2,0 - 4,0 μm, trực
khuẩn nhỏ thƣờng gặp ở dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4]. Chúng thuộc gram dƣơng,
không có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose,
maltose, lactose và mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose. Nhiệt độ phát triển

40 - 46
o
C. Chúng không có khả năng tạo nitrit từ nitrate. Có khả năng lên men
glucose, fructose, maltose, saccharose. Trong môi trƣờng khoai tây chúng tạo 1,3 %
acid lactic [18].
- Lactobacillus helveticcus
Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc 0,7 - 0,9 μm; 2,0 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên
chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào, cũng có thể tồn tại thành từng chuỗi tế bào.
Nhiệt độ phát triển 40 - 42
o
C. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose,
galactose, maltose và lactose [9].
8

- Lactobacillus thermophillus
Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,5 - 3,0 μm, không có khả năng di
động. Lên men đƣợc glucose, lactose, sucrose, tinh bột và dạng glycerol. Không tạo
acid từ mannitol. Lên men đƣợc fructose, galactose, maltose và dextrin. Không tạo
nitrit từ nitrate. Nhiệt độ tối ƣu 50 - 62,8
o
C. Nhiệt độ tối thiểu 30
o
C, nhiệt độ tối đa
65

chuyển hóa glucose. Quá trình này tạo acid lactic là sản phẩm chính từ lên men
glucose đƣợc gọi là lên men đồng hình. Số lƣợng acid lactic đồng hình thu đƣợc nhiều
hơn lactic dị hình khoảng 2 lần. Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lƣợng
mole lactat, CO
2
và ethanol bằng nhau.
9

Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình [20]
Lên men đồng hình Lên men dị hình
Sinh vật Dạng
lactat
% G+C Sinh vật Dạng
lactat
% G+C
Lactobacillus Lactobacillus
L. acidophilus DL 36,7 L. brevis DL 42,7 - 46,4
L. bulgaricus D(-) 50,3 L. buchneri DL 44,8
L. casei L(+) 46,4 L. cellobiosus DL 53
L. coryniformis DL 45 L. coprophilus DL 41,0
L. curvatus DL 43,9 L. fermentum DL 53,4
L. delbrueckii D(-) 50 L. hilgardii DL 40,3
L. helveticus DL 39,3 L. sanfrancisco DL 38,1 - 39,7
L. jugurti DL 36,5-39,0 L. trichoides DL 42,7

2.3.1. Vi khuẩn lactic dị hình [9]
Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng thiếu hai loại enzym quan trọng đó là
aldolase và hexose isomerase. Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng
thƣờng đƣợc tiến hành theo con đƣờng hexose monophosphate hay gọi là con đƣờng
pentose phosphate (PP ) . Quá trình chuyển hóa đƣờng đƣợc trình bày nhƣ sau: 2.3.2.Vi khuẩn lactic đồng hình
Quá trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase và hexose isomerase
nhƣng thiếu phosphoketolase. Chúng sử dụng con đƣờng Embden-Meyerhof-Parnas
(EMP) để tạo 2 phân tử lactat từ 1 phân tử glucose [9], [19], [20]. Quá trình chuyển
hóa đƣợc trình bày nhƣ sau:
11
cơ từ nguồn vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải sử dụng
nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng. Tuy nhiên, để sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng thì
ngoài nitơ dƣới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những cơ chất hữu cơ
phức tạp có chứa nitơ nhƣ: cao thịt, cao nấm men, pepton, casein…[13].
Bảng 2.3 Các acid amin cần thiết cho vi khuẩn lactic [34]
L-Alanine Glycine L-Proline
D-Alanine L-Histidine L-Serine
L-Arginine L-Isoleucine L-Threonine
L-Acid aspartic L-Leucine L-Tryptophan
L-Cysteine L-Lysine L-Tyrosine
L-Acid glutamic L-Phenylalanine L-Valine
13

2.4.1.3. Nhu cầu về vitamin
Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển và các vitamin này đóng vai trò là
coenzym trong quá trình trao đổi chất của chúng. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng
hợp đƣợc vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ: riboflavin, tiamin, biotin.
Bảng 2.4 Các vitamin và các yếu tố có liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn lactic [34]
Yếu tố phát triển Các sinh vật đại diện mà đòi các hợp chất cho sự
phát triển
p-Acid aminobenzoic Lactobacillus plantarum
Lactobacillus arabinosus
Biotin Lactobacillus plantarum
Leuconostoc mesenteroides


Lactobacillus lactis

Vitamin B
12
Lactobacillus lactis
Lactobacillus leichmannii

14

2.4.1.4. Nhu cầu về các chất hữu cơ
Ngoài các nguồn dinh dƣỡng trên, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các
hợp chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của chúng nhƣ purine, pyrimidine. Acid
hữu cơ nhƣ acid acetic và nhiều acid hữu cơ không bay hơi khác. Tween 80 là một dẫn
xuất của acid oleic, là một loại acid hữu cơ quan trọng có ảnh hƣởng đến sự sinh
trƣởng của hầu hết các loại vi khuẩn lactic. Ngoài ra các acid béo cũng ảnh hƣởng lên
sinh trƣởng của các vi khuẩn lactic nhƣng cơ chế còn chƣa đƣợc biết rõ [2].
2.4.1.5. Nhu cầu các muối vô cơ
Để đảm bảo cho sự sinh trƣởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các
hợp chất vô cơ. Phosphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu.
Các muối amôn không thể đƣợc dùng làm nguồn nitơ duy nhất song hình nhƣ chúng
gây một ảnh hƣởng nhất định lên sự chuyển hóa một số acid amin. Đối với
Lactobacillus thì Mn
2+

trƣờng bên ngoài. Để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào,
chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trƣờng dinh dƣỡng làm nguồn carbon
15

(chủ yếu là đƣờng lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và
các nguyên tố vi lƣợng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dƣỡng trên với liều
lƣợng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men.
2.4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hƣởng tới sinh trƣởng.
Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng manh.
2.4.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường
Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giới hạn pH nhất định của môi trƣờng nuôi
cấy. Với vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trƣờng thƣờng không ảnh hƣởng
đến các sản phẩm đặc trƣng của quá trình lên men, còn đối với vi khuẩn lactic dị hình,
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến việc tạo thành các sản phẩm lên men. Khi pH môi
trƣờng cao thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic, còn khi pH môi trƣờng thấp thì
ngoài acid lactic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm phụ khác.
Acid mới tạo thành phải đƣợc trung hòa liên tục. Để lên men nhanh và trọn vẹn,
phạm vi pH tối ƣu phải nằm giữa 5,5 và 6,0. Lên men bị ức chế mạnh ở pH = 5 và sẽ
dừng lại ở các pH dƣới 5 [2]. Khi acid lactic đƣợc hình thành và nồng độ tăng dần
trong quá trình lên men thì pH sẽ giảm và nồng độ acid lactic đạt khoảng 2,2% sẽ ức
chế vi khuẩn lactic [15].
2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ acid
Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi

Acid lactic đƣợc sử dụng nhƣ là một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tinh dầu,
dịch quả, mứt, sirô. Ngoài ra, acid lactic còn đƣợc dùng để acid hóa rƣợu vang và hoa
quả nghèo acid, acid hóa dịch đƣờng hóa trong công nghiệp sản xuất rƣợu mạnh và để
sản xuất bột chua trong ngành bánh mì.
- Ứng dụng để sản xuất dƣa chua
Quá trình muối chua rau, quả chính là quá trình hoạt động sống của vi khuẩn
lactic và vi khuẩn acetic. Trong quá trình phát triển của chúng, trong rau quả, khi lên
men sẽ tạo ra acid lactic và acid acetic cùng một số loạt acid hữu cơ khác. Các acid
hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tƣợng gây thối rau, quả. Mặt khác
nhờ có lƣợng acid hữu cơ đƣợc tạo thành sẽ làm tăng hƣơng vị của khối ủ chua rau,
quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản [9].
- Ứng dụng để làm chua quả
Trƣớc đây, ngƣời ta thƣờng sử dụng acid acetic để ngâm chua quả. Sau này
ngƣời ta sử dụng acid lactic để ngâm chua quả. Phƣơng pháp thay thế này tỏ ra hiệu
quả vì chúng ít làm thay đổi màu tự nhiên của quả và vẫn đảm bảo chất lƣợng quả
ngâm chua.
- Ứng dụng trong sản xuất tƣơng
Sản xuất tƣơng theo phƣơng pháp của miền Bắc (Việt Nam) có giai đoạn ngả
nƣớc đậu sau khi rang. Quá trình ngả nƣớc đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác
nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng
hƣơng vị cho sản phẩm.
17
Các thầy thuốc đã tạo ra một vị thuốc bao gồm acid lactic kết hợp với cây kim sa
có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi và có khả năng làm việc và hoạt động liên
tục trong thời gian dài.

18

- Ứng dụng acid lactic trong phẫu thuật chỉnh hình
Trong phẫu thuật chỉnh hình, ngƣời ta thƣờng sử dụng loại vật liệu có tên là
purasorb. Purasorb là một hợp chất cao phân tử đƣợc sản xuất từ acid lactic. Thành
phần của purasorb bao gồm: lactides, glycolide, polylactides, polyglycolide,
lactide/glycolide copolyme. Purasorb đƣợc sử dụng nhƣ những định ghim, gắn phần
xƣơng lại với nhau; khi xƣơng định hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy [9]. Một loại thanh
dẫn có thể mang 20 lớp thuốc khác nhau vừa đƣợc các chuyên gia Singapore sáng chế.
Đây là loại thanh dẫn tự tiêu đầu tiên trên thế giới giúp ngƣời bệnh tim mau chóng
bình phục đồng thời giảm thiểu nguy cơ nhiễm trùng và phát bệnh trở lại. Các nhà phát
minh thuộc Đại học Công nghệ Nanyang cho rằng, với loại thanh dẫn này, bác sĩ có
thể kết hợp nhiều loại thuốc phù hợp với từng loại bệnh trạng của từng ngƣời để tăng
hiệu quả điều trị. Khi đƣợc đƣa vào cơ thể, thanh dẫn sẽ nhả thuốc vào từng thời điểm
khác nhau kéo dài trong nhiều tháng. Khi hết thuốc nó sẽ tự hủy hoàn toàn. Thanh dẫn
đƣợc chế tạo bằng PLA và PLGA, khi vào cơ thể sẽ chuyển hóa thành acid lactic và có
thể hấp thụ vào máu. Không chỉ đƣợc sử dụng trong động mạch vành tim, loại thanh
dẫn tự hủy này có thể đƣợc cấy trong não, phôi, đƣờng niệu hoặc bất kì cơ quan nào bị
nghẽn mạch máu. Đƣợc biết, các loại thanh dẫn hiện nay đều làm bằng kim loại và chỉ
mang đƣợc một loại thuốc duy nhất, có thể gây tụ huyết khối và làm mạch máu tắc

2.5.4. Trong mỹ phẩm [9][22]
Các loại lactat kim loại (chẳng hạng nhƣ lactat natri) đƣợc sử dụng trong thành
phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da nhƣ punosal và của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ
phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng
da [9].
2.6. Sản xuất acid lactic
2.6.1. Mật rỉ đường [1], [8], [12]
Là phế liệu chứa nhiều đƣờng không kết tinh trong sản xuất đƣờng từ mía hoặc
củ cải đƣờng. Thông thƣờng tỉ lệ rỉ đƣờng trong sản xuất đƣờng mía chiếm khoảng 3 –
5 % trọng lƣợng mía. Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ sản xuất
đƣờng.v.v.
Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau: Nƣớc chiếm 15 – 20 %; chất khô chiếm
80 – 85 %. Trong chất khô có 60 % là đƣờng (40 % là đƣờng saccharose và 20 % là
fructose và glucose) và 40 % chất khô còn lại là chất không phải là đƣờng (phi đƣờng).
Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30 – 32 % hợp chất hữu cơ và 6 – 10 % hợp
chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ, theo Mắc-Dinit, gồm có K
2
O: 3,5 %; Fe
2
O
3
: 0,2 %;
MgO: 0,1 %; sulfat: 1,6 %; CaO: 1,5 %; SiO
2
: 0,5 %; P
2
O
5
: 0,5 %; Clorit: 0,4 %.
Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa nitơ
Acid lactic
tinh thể
Mật rỉ
Xử lý
Lên men
Trung hòa
Lactat canxi

3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Chế phẩm Biolactyl của Pháp
- Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc
- Đại mạch của trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH,
máy li tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nƣớc và bếp điện.
- Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ống
nghiệm, buret, phễu chiết, pipet và pipetman.
3.2.4. Môi trường nuôi cấy
- Môi trƣờng MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36]
- Môi trƣờng MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar)
- Môi trƣờng YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37]
- Môi trƣờng thử khả năng lên men đƣờng [11]
- Môi trƣờng thạch nitrate bán lỏng
- Môi trƣờng thử khả năng phân giải gelatin
- Môi trƣờng thạch bán lỏng di động
- Môi trƣờng thử khả năng sinh indol
Thành phần và tỉ lệ môi trƣờng nuôi cấy đƣợc trình bày ở mục 1 phần phụ lục.

22

tĩnh ở nhiệt độ 37
o
C. Ghi nhận các đặc điểm sinh trƣởng trong 24 giờ.
3.3.1.2. Quan sát vi thể
Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính x100 [5] (Xem ở
mục 3.2 phần phụ lục).
3.3.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31]
- Thực hiện
+ Cấy vi khuẩn đã phân lập đƣợc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS
dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37
o
C trong 24 giờ.
+ Li tâm thu dịch trong.
23

+ Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. Quan sát sự đổi màu.
Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng:
+ Ống 1: 5 ml môi trƣờng MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen.
+ Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen.
3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11]
- Nguyên tắc: Hàm lƣợng acid trong dịch lên men có thể định lƣợng đƣợc bằng
dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein.
- Thực hiện: ( xem ở mục 3.1 phần phụ lục)
3.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa

- Ảnh hƣởng thời gian
Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống. Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào
10 ml môi trƣờng (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Đem khảo sát ở các thời
24

điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch
nuôi cấy tƣơng ứng.
3.3.4.2. Đặc điểm sinh hóa
- Thử phản ứng catalase
- Kiểm tra khả năng sinh indol
- Xem khả năng di động
- Khả năng khử nitrate
- Khả năng phân giải gelatin
- Khả năng đông vón sữa
- Khả năng lên men nguồn carbohydrate
Cách tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem mục 3.5 phần phụ lục)
3.3.5. So sánh về sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc: A, B, D
- Môi trƣờng cấp 1
Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho
10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện
thích hợp của chúng, trong 24 giờ.
- Môi trƣờng cấp 2
Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml
MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ.

+ Thực hiện
* Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu đƣợc dịch huyền phù
có các giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
* Đếm số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc tƣơng ứng với 5 giá trị
OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Suy ra mật độ tế bào trong 1 ml dịch huyền phù.
* Dựng đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục
của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x).
3.3.6.3. Qui trình sản xuất

Mật rỉ
Xử lý
Lên men
Trung hòa
Lactat canxi
Lọc