BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- o0o -------
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ
CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI
PB260 X RO44/268 BẰNG
KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH
Tháng 08/2007



iii

LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ
Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức
quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp .
TS. Bùi Minh Trí, ThS. Lại Văn Lâm và KS. Trần Thanh đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
KS. Vũ Thị Quỳnh Chi đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa
luận này.
ThS. Lê Mậu Túy/ Trưởng Bộ Môn Giống Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam cùng
các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống/Viện Nghiên Cứu Cao
Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện
Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam.
Những người bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt những năm học cũng như thời
gian thực tập tốt nghiệp.
Và con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để
con được như ngày hôm nay.


v
đến 0,478. Kết quả này cho thấy quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có
biến lƣợng di truyền khá rộng.
- Kết quả phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu RAPD cho thấy chƣa có mối
liên hệ nào đƣợc phát hiện giữa các đặc tính nông học (sinh trƣởng hoặc sản lƣợng)
và marker RAPD thông qua 2 primer A18 và OPB12.
Qua kết quả trên, bƣớc đầu cho thấy marker RAPD đã phản ánh đƣợc biến
lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268.
Kết quả đề tài góp phần tạo tƣ liệu nghiên cứu di truyền nhằm nhằm sử dụng
hiệu quả nguồn di truyền Amazone vào chƣơng trình cải tiến giống cây cao su
Hevea.
vi
MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................... iii

2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ............... 14
2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................... 14

2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU19
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 21
3.1.1 Vật liệu di truyền ..................................................................................... 21
3.1.2 Hóa chất thí nghiệm................................................................................. 21
3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA ...................................................................... 21
3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD ........................................... 21
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ................................................................... 22
3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................... 22
3.2.1 Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 22
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 22
3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 22
3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA ................................................... 22
3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu .......... 23
3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA ................................................................ 24
3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại ....................... 24
3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết quả ............................................................... 24
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ........................................................... 25
4.1 LY TRÍCH DNA ............................................................................................ 25

viii
4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose ........... 25
4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical
Density) ............................................................................................................ 26
4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD ........................................ 26
4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE ................................................................. 27
4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER ......................................... 29

NTSYSpc: Numercial Taxonomy System
OD: Optical density
PCR: Polymerase Chain Reaction
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
SSR: Simple Sequence Repeat (microsatellite)
STS: Sequence-Tagged Sites
SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism
Taq: Thermus aquaticus
UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average
UV: Ultra violet
VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam
SALB: South American Leave Blight
x
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD ................... 27
Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD ................................................. 27
Bảng 4.3: Số băng DNA đƣợc khuếch đại ở các primer ...................................... 29
Bảng 4.4: Số băng DNA đƣợc khuếch đại của các con lai nghiên cứu ............... 30

liệu phân tích RAPD, sử dụng phƣơng pháp phân tích cluster UPGMA ............. 36 1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây cao su, Hevea brasiliensis Muell. Arg thuộc chi Hevea, họ
Euphorbiaceae có nguồn gốc từ vùng rừng thuộc lƣu vực sông Amazon, Nam Mỹ.
Vùng sinh thái tự nhiên của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm. (Trần Thị Thúy
Hoa, 1998).
Cây cao su là cây công nghiệp có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần
cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Cây cao su là loài cây cung cấp nguồn
nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp, đƣợc xếp sau dầu hỏa, than
đá và gang thép. Bên cạnh các sản phẩm truyền thống từ mủ cao su, cây cao su còn
có khả năng cung cấp một khối lƣợng gỗ có giá trị kinh tế cao sau chu kỳ kinh
doanh. Mặt khác, hiện nay cây cao su còn đƣợc xem là thành phần trong cơ cấu cây
trồng có thể đáp ứng chủ trƣơng phủ xanh đất trống, đồi trọc, tái tạo rừng, cải tạo
môi sinh. Tuy nhiên, sự giới hạn nguồn gen ở các nƣớc châu Á là yếu tố quan trọng

bằng marker RAPD. Qua đó cung cấp tƣ liệu cho chƣơng trình tạo tuyển giống cao
su với nguồn di truyền Amazon.
1.2.2 Yêu cầu
- Ly trích DNA của các con lai, đảm bảo hàm lƣợng và độ tinh sạch cao, làm
nguyên liệu cho phản ứng RAPD.
- Đánh giá đƣợc biến lƣợng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x
RO44/268 qua việc phân tích RAPD.

3
- Đánh giá mối liên hệ giữa marker RAPD và các đặc tính sinh trƣởng hoặc
sản lƣợng của các con lai.
- Nắm vững kỹ thuật PCR, thao tác chính xác, hạn chế sai sót trong quá trình
thực hiện.
- Sử sụng thành thạo các phần mềm xử lý thống kê sinh học nhƣ: NTSYS-pc,
Excel.
1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
Do giới hạn về thời gian nên các nghiên cứu của đề tài chỉ phân tích RAPD
dựa trên 2 primer A18 và OPB12.

4

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg) là một loài thuộc chi Hevea, họ
Euphorbiaceae. Trong chi Hevea, còn có 9 loài Hevea khác: H. benthamiana, H.
camargona, H. camporum, H. guianensis, H. nitida, H. microphylla, H. pauciflora,
H. rigidifolia và H. spruceana. Mặc dù tất cả các loài Hevea đều có mủ cao su

nhanh chóng giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan. Theo thống kê năm 2002,
tổng diện tích cao su trên toàn thế giới khoảng 9 triệu ha và sản lƣợng khoảng 7,4
triệu tấn, trong đó các nƣớc châu Á chiếm khoảng 94% tổng sản lƣợng, gồm các
nƣớc: Thái Lan (28,7%), Indonesia (24,9%), Malaysia (16,9%), Ấn Độ (10%),
Trung Quốc (6,1%), Việt Nam (3,3%), Srilanka (2,1%), các nƣớc châu Á khác
(2,1%), châu Phi chiếm khoảng 4,4% và châu Mỹ là 1% tổng sản lƣợng cao su trên
thế giới. Năng suất cao su trung bình biến thiên từ 1.500 - 1.800 kg/ha/năm tuỳ
thuộc vào trình độ ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và quản lý của từng quốc gia
trồng cao su (Phạm Hải Dƣơng, 2002).
Đến năm 2005, tổng diện tích cao su Việt Nam đạt khoảng 480.200 ha, tổng
sản lƣợng đạt 468.600 tấn, năng suất bình quân đạt 1.480 kg/ha/năm, trong đó bình
quân năng suất của Tổng Công ty Cao su Việt Nam là 1.728 kg/ha (Trần Thị Thúy
Hoa, 2006)
2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su
Cây cao su là loài đại mộc, trong tự nhiên có thể sống đến 100 năm và cao từ
30 – 50 m, chiếm diện tích từ 20 – 40 m
2
, vòng thân có thể đạt 3 – 5 m, thƣờng là
1,5 m. Tuy nhiên, trên các vƣờn sản xuất, mức độ sinh trƣởng của cây cao su bị hạn
chế, ít khi cao hơn 25 m, vòng thân khoảng 1 - 1,2 m do mật độ trồng dày, lại bị
khai thác mủ liên tục và thƣờng bị cƣa đốn để tái canh sau 25 - 30 năm.
Cây cao su có 3 lá chét, hoa nhỏ màu vàng, đơn tính đồng chu với tỷ lệ hoa
đực gấp 60 lần hoa cái, thụ phấn chéo và tự thụ đều có thể xảy ra, quả có 3 mảnh vỏ
chứa 3 hạt, quả tự khai, hạt khá lớn với kích thƣớc khoảng 2 cm, trong hạt có chứa
nhiều dầu, dễ mất sức nẩy mầm. Khi trên 4 - 5 tuổi, cây cao su bắt đầu ra hoa sau
thời kỳ thay lá. Ở Việt Nam, vụ hoa vào khoảng tháng 2 – 3 hàng năm, có khi rải
rác trong tháng 4 – 6. Trong tự nhiên, cây cao su thụ phấn nhờ gió và côn trùng. Tỷ

6
lệ đậu trái trong tự nhiên rất thấp – dƣới 3%, có thể sự cạnh tranh dinh dƣỡng và

kiến thiết cơ bản kéo dài hơn. Cây cao su ƣa đất hơi chua (pH đất thích hợp từ 4,5 -
5,5). Yêu cầu hóa tính đất cho việc trồng cao su không khắt khe nhƣng lý tính đòi
hỏi phải tốt, tầng đất dày, không úng và địa hình ít dốc là tốt nhất. Cây cao su phát
triển bình thƣờng ở nơi có tối thiểu 1600 giờ nắng/năm, phát triển tốt ở điều kiện
gió nhẹ (vận tốc gió khoảng 3 m/s), nếu vận tốc gió lớn hơn 17 m/s cây bị gãy thân,
cành. Nếu tốc độ gió lớn hơn 25 m/s cây sẽ gãy thân và lật gốc. Mức độ thiệt hại do

7
gió phụ thuộc vào đặc tính di truyền giống và kỹ thuật canh tác. Tuy nhiên, nhờ
những thành công trong công tác tuyển chọn giống và các biện pháp nông học, hiện
nay cây cao su đã và đang phát triển ra ngoài vùng truyền thống với độ cao lớn, vĩ
độ lớn.
Mủ cao su là sản phẩm chính đƣợc thu hoạch, hình thành từ các sản phẩm
của quang hợp. Mủ cao su hiện diện trong nhiều bộ phận của cây, nhƣng quan trọng
nhất là ở các vòng ống mủ nằm trong vỏ thân. Khi khai thác, các vết cắt làm đứt hệ
thống ống mủ và cao su chảy ra ngoài, sau vài giờ sẽ ngƣng lại. Dòng mủ sẽ tiếp tục
chảy với sản lƣợng tƣơng đƣơng ở lần cạo kế tiếp cách ít nhất một ngày đến vài
ngày. Khả năng tái sinh mủ cao su phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính di truyền giống.
Chu kỳ sinh trƣởng và phát triển của cây cao su đƣợc chia làm 2 giai đoạn
chính:
- Thời kỳ chƣa trƣởng thành (giai đoạn kiến thiết cơ bản): giai đoạn này bắt
đầu từ khi trồng đến khi khai thác mủ (vòng thân đo cách mặt đất 1m đạt khoảng 50
cm). Tốc độ sinh trƣởng của cây trong giai đoạn này là rất nhanh, kích thƣớc vòng
thân có thể tăng 7 – 10 cm/năm. Cây chuyển sang thời kỳ trƣởng thành khi hoa xuất
hiện sau 5 - 6 tuổi. Thông thƣờng, giai đoạn kiến thiết cơ bản của cây cao su từ 5 - 7
năm, tùy thuộc vào đặc tính của giống, điều kiện chăm sóc và điều kiện môi trƣờng.
- Thời kỳ trƣởng thành (giai đoạn kinh doanh): là giai đoạn khai thác mủ,
thông thƣờng giai đoạn này kéo dài khoảng 20 - 30 năm cho đến khi cƣa đốn do
hiệu quả kinh tế giảm. Diễn biến sản lƣợng mủ tùy thuộc vào đặc tính giống và điều
kiện canh tác, phần lớn các giống sẽ cho năng suất cao nhất ở tuổi trung niên khi

mẹ dị hợp tử để tạo ra các con lai F1, sau đó sẽ tiến hành chọn lọc một số cá thể F1
xuất sắc để tạo thành những dòng vô tính đồng đều về kiểu hình và cố định đƣợc
kiểu gen. Cho đến nay, những thử nghiệm lai hoa nhân tạo giữa các loài cao su khác
nhau cho thấy không có sự cản trở về di truyền. Trong thực tế, ngƣời ta đã tạo ra

9
nhiều tổ hợp lai khác loài cho mục đích nghiên cứu cũng nhƣ tìm thấy nhiều dạng
lai khác loài Hevea trong tự nhiên (Trần Thị Thuý Hoa, 1998).
2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su
Nguồn hạt do Wickham thu thập ở Brazil chuyển về trồng ở Singapore đƣợc
xem là thủy tổ của hầu hết diện tích cao su của châu Á và châu Phi hiện nay. Trong
thời kỳ này cao su đƣợc trồng bằng hạt thực sinh không chọn lọc nên sản lƣợng rất
thấp dƣới 500 kg/ha (Võ Thị Thu Hà, 1996). Theo báo cáo của Cramer năm 1910,
trong vƣờn cao su thực sinh có sự biến thiên rất lớn về sản lƣợng giữa các cá thể,
qua phân tích sự biến thiên ông nhận thấy khoảng 70% sản lƣợng của cả vƣờn cây
là từ khoảng 30% số cây trong vƣờn cung cấp. Từ đó ông khuyến cáo chọn lọc cây
đầu dòng đƣợc trồng từ những hạt thực sinh của những cây cho năng suất cao trên
vƣờn. Kết quả thu đƣợc từ vƣờn trồng có chọn lọc đã đƣa năng suất bình quân lên
630 – 704 kg/ha (Phạm Hải Dƣơng, 2002). Sau đó các nguyên tắc chọn lọc giống
cao su lần đầu tiên đã đƣợc công bố tại hội nghị ở Batavia (Indonesia) vào năm
1914. Năm 1917, Van Helten đã thành công trong phƣơng pháp nhân giống vô tính
cây cao su bằng kỹ thuật ghép mầm ngủ trên gốc thực sinh. Phƣơng pháp này đã mở
ra một hƣớng đi mới trong tạo tuyển giống cao su là tạo các dòng vô tính. Qua các
giai đoạn tuyển chọn, các dòng vô tính xuất sắc sẽ đƣợc khuyến cáo cho sản xuất
đại trà.
Mục tiêu chung của các nƣớc trồng cao su trong công tác chọn tạo giống là
nâng cao sản lƣợng, đồng thời cải tiến những đặc tính có liên quan đến sản lƣợng
nhƣ: sinh trƣởng, kháng bệnh, kháng gió,… Những phƣơng pháp cải tiến giống
thƣờng đƣợc sử dụng trên thế giới bao gồm chọn lọc cây đầu dòng, lai hoa nhân tạo,
lai hoa tự do, đột biến và đa bội hóa nhiễm sắc thể. Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy in-

11
2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG
TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ
2.2.1 Chỉ thị hình thái
Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát
mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hƣởng do tác động của môi trƣờng, có thể
đƣợc dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000).
Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình
nhƣng chúng lại có những hạn chế nhất định nhƣ cho kết quả sai lệch do tƣơng tác
kiểu gen với môi trƣờng, số lƣợng marker có giới hạn, chỉ ở qui mô hình thái và chỉ
thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.2.2 Chỉ thị isozyme
Trong nghiên cứu di truyền học phân tử, isozyme là một trong hai loại
marker cơ bản. Isozyme là chỉ thị sinh hoá, chúng là những enzyme có cùng chức
năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tƣơng tự hoặc giống nhau) nhƣng
lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Hoạt tính của chúng đặc trƣng với một
cơ chất và trợ enzyme nhất định. Về mặt di truyền có thể chia isozyme thành hai
dạng (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997):
- Isozyme đơn gen: các isozyme này chịu sự kiểm soát của một gen, mặc dù
chúng chúng đều đƣợc hình thành từ chuỗi polypeptide đơn nhƣng có thể có các
kiểu phân tử khác nhau (do sự khác nhau về thành phần và trật tự các acid amin), và
do vậy có thể phân tách chúng bằng điện di.
- Isozyme đa gen: các isozyme này đƣợc mã hoá bởi hai hay nhiều gen và
chúng có thể đƣợc phân biệt bằng các đặc điểm hoá miễn dịch hoặc bằng đặc tính
enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997).


PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có
quy trình thực hiện khó nhƣng kết quả có độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999).
2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites)
Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, STS là đoạn ngắn DNA giúp phân tích
bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật này dựa trên
nguyên lý: trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR
nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di (Nguyễn Thị
Lang, 2002). Kỹ thuật này có nhƣợc điểm là phải biết trình tự gen của đối tƣợng
nghiên cứu.
2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat)
Nguyên lý của kỹ thuật này là giữa những giống khác nhau có một đoạn
DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides
đƣợc lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng
các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là
phải biết đƣợc những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng
giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu đƣợc dùng để định danh những
giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền (Nguyễn Thị Lang, 2002).
2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos phát
minh năm 1993, sau đó đƣợc Vos và ctv (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát
triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp
primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm
ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt giới hạn từ bộ
gen của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng
từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của
quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002).

14