Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

LÊ PHƢƠNG DUNG

PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL
ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN
GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA
REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS
UROPHYLLA S.T. BLAKE)
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009

Thai Nguyen, 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả
nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa có ai công bố trong
một công trình nào khác. Tác giả

Lê Phƣơng Dung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................
1.1. Tổng quan về cây bạch đàn .........................................................................
1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam ........................................................
1.3. Tình hình sinh trƣởng của cây bạch đàn ở Việt Nam …………………….
1.4. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .....................................
1.4.1. Lignin ..................................................................................................
1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .............................................
1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase
(CAD)
1.5. Tổng quan về promoter ...............................................................................
1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. .......................

3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. ................
3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. .....................................
3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp ...................................................................
3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2....

3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của
promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T
Blake..... ............................................................................................................
3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl
alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI ...................................
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19
Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết ... 21
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA ... 22
Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23
Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23
Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ... 24
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR ... 24
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng ..26
Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid .. 28
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt ... 29
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR ...29
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối ... 31
Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR ... 32

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn ....................... 34
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 .................... 35
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 .................... 36
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch.....37
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37
Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................... 39
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .....41
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .... 41
Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ……. 42
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter
CAD1 ................................................................................................................ 43
Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter
CAD2 ................................................................................................................. 44
Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và
CAD2 ................................................................................................................. 45
Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii ............ 46
Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……………………….. 48
Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% .............................. 51
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA ................................................................ 51
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR .......................................... 53
Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% .... 54
Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR ..................... 56
Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả
biến E.Coli DH5 ...... 56
Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR .... 58
Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR ...
59
Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R
.... 61

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
bp base pair
cDNA Complementary DNA
DNA Deoxyribonucleic Acid
DEPC Diethyl pyrocarbonate
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid
g/l Gam/lít
IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside
Kb Kilobase
kDa KiloDalton
LB Luria Bertani
mg/l miligam/lít
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
SDS Sodium dodecyl sulphate
TAE Tris - Acetic acide - EDTA
Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase
TE Tris – EDTA
v/p vòng/phút
X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
TÀI LIỆU THAM KHẢO

10. Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto
D.S., Yellanki P., Carlson J.E. (2009), The cinnamyl alcohol
dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and
expression. BMC Plant Biology. 9(26): 1-15.
11. Chiang, V. L., (2006). Understanding Gene Function and Control in
Lignin Formation in Wood. NABC Report.
12. Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin. Volume 4, number 4.
13. Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima
P.J. (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol
dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular
Biology. 4(27): 651-667.
14. Fiona S. Poke1, René E. Vaillancourt, Robert C. Elliott and James B.
Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes,
cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2
(CAD2). Molecular Breeding 12: 107–118, 2003.
15. Gawel N. J. and Jarret R. L. (1991), A modified CTAB DNA extraction
procedure for Musa and Ipomoea. Plant Molecular Biology Reporter.
3(9): 262-266.
16. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau
A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J.
(2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,
regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. The Plant
Journal. 43(4): 553-567.
17. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003),
Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in
transgenic tobacco. Plant Growth Regulation. 41: 279-286.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J. C.
(1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of
promoter activity in transgenic Poplar. Plant Physiology. 113: 321-325.

tobacco plants. The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270.
25. pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits (6 April 2006). Invitrogen
26. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York.
27. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and
Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:
Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar.
Plant Physiol 113: 321-325.
28. Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa,
Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki
Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA reductase, a key
enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in
defense signaling in rice. PNAS vol. 103 no. 1, pg. 230–235.
28. Whettena R. and Sederoffa R. (1995), Lignin Biosynthesis. The Plant Cell.
7: 1001-1013.
29. Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X. (2004), A Simple Protocol for Isolating
Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and
PCR Analyses. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g.

TÀI LIỆU WEB
30.
31. />c=061.0.
32.
33.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Phụ lục 1. Kết quả phân tích độ tương đồng giữa 26 loài thực vật
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
1 Zea_mays
2 Arabidopsis_thaliana 0.49

1.1. Lý do chọn đề tài
Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau
cellulose. Nó chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và
gần 35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật. Quá trình tổng
hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá
trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn. Lignin
giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân.
Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh
dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm
bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các
nhân tố gây bệnh [7]. Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền. Bởi vậy, nó
là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất,...) và là
một loại nhiên liệu hoàn hảo.
Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm
lượng lignin cao lại là một trở ngại. Việc loại bỏ lignin trong quy trình sản xuất
bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém đối với
điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay [27]. Vậy làm thế nào để điều
chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật
và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong
xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng
lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy.
Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin,
quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như
enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol
dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis
thaliana, Populus trichocarpa) [7],[10],[18].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của một số enzyme tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây

0
Nam. Bạch
đàn mọc tự nhiên và có nguồn gốc từ châu Úc, chúng có thể sinh trưởng dưới
một phổ sinh thái rộng như tập trung ở các vùng thấp ven biển, nhưng cũng có
thể mọc ở những vùng cao (2000m so với mặt biển) hay vùng khô cạn (sa mạc
hoặc bán sa mạc) [4].
Cây bạch đàn thuộc loại đại mộc, cao 25 – 50m, có cây cao tới 100m.
Đường kính thường đạt 120-180 cm. Vỏ ngoài màu xám trắng hoặc nâu, đỏ
nâu, xám xanh…, bong mảng hoặc nứt dọc, vỏ thân chứa tinh dầu
Eucalyptone thơm mùi dầu tràm. Lá đơn, khi cây còn non lá thường mọc đối,
sau đó có dạng lá đơn mọc cách, không có lá kèm; mép lá nguyên, phiến lá
dày, gân phụ thường nối với nhau ở đầu gân thành một đường song song với
mép lá. Hoa lưỡng tính, nụ hình thoi. Khi hoa nở nửa trên hình chóp nón rụng
đi, để lộ nhị và nhụy. Nhị nhỏ, rời nhau, rất nhiều, màu trắng vàng. Nhuỵ có
bầu trung, một phần gắn liền với ống đài, một phần nhô lên. Quả khô, khi
chín nứt ở đỉnh. Hạt nhiều, thường có góc cạnh, rất nhỏ.
Ngày nay bạch đàn là một trong những loài cây gỗ lâm nghiệp rất quan
trọng, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt là ở các
vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45
o
N và 40
o
B như: Braxin, Trung
Quốc, Ấn Độ, … với diện tích canh tác khoảng 12 triệu hecta [4]. Ở Việt Nam
đã gây trồng bạch đàn từ những năm 1930 ở cả hai miền Nam, Bắc. Hiện nay
có 10 loài bạch đàn đang được trồng phổ biến là:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
+ Bạch đàn urô Eucalyptus urophylla, thích hợp với vùng đất đồi
trung du.

3000mm/năm. Trên vùng đất đồi trung du Phú Thọ, bạch đàn urô 4 tuổi có
chiều cao trung bình là 10,34m, đường kính trung bình của thân đạt 9,54cm
và sinh khối gỗ đạt 34.108kg/ha [6].
Cũng như nhiều loài bạch đàn khác, bạch đàn urô cho gỗ cứng làm
nguyên liệu sản xuất giấy, đóng đồ dùng thông thường… Ngoài ra, nó còn
được dùng làm cực truyền điện, các cột trụ lâu dài và cột xây dựng, trong
kết cấu nặng hoặc nhẹ, đồ mỹ nghệ và làm gỗ dán boong tàu. Nó có vai trò
bảo vệ trên các bờ sông và tạo bóng mát. Vì các loài này không có nhu cầu
thổ nhưỡng lớn, nên nó thích hợp cho việc tái sinh rừng ở cả đất bị ngập
nước và đất khô của vùng nhiệt đới thấp.
Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, hiệu suất
cao và tin sinh học, nhiều nghiên cứu về bộ gen của các loài cây đã được giải
mã thành công, như cây (Arabidopsis thaliana) và đặc biệt trong số này bao
gồm cả những loài cây quan trọng trong nông nghiệp như lúa (Oryza sativa)
và trong lâm nghiệp như cây dương (Populus trichocarpa). Thông tin về bộ
gen của những loài cây này đã trở thành những công cụ rất có giá trị trong các
nghiên cứu về chức năng và sự tương tác giữa các gen, những nghiên cứu về
tiến hoá và sự phân bố gen trong các quần thể thực vật. Thực vật hạt kín được
cho là có nhiều điểm tương đồng về bộ gene, các quá trình trao đổi chất với
các loài cây mô hình, chính vì vậy mà những nghiên cứu trên các loài cây này
là những thông tin và công cụ quan trọng cho các loài cây thuộc họ khác, ví
dụ chi Bạch đàn (Eucalyptus) của họ Sim (Myrtaceae) [10].
Những nghiên cứu về gen trên cây bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh
về cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen. Đặc điểm của
bộ gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, được xác định dựa trên việc tạo ra
bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lượng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng
và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các

(mật độ trồng quy đổi là 1660 cây/ha).
Như vậy, có thể thấy rừng trồng bạch đàn đã chiếm một tỷ lệ khá lớn
trong diện tích rừng trồng của cả nước, đồng thời diện tích trồng bạch đàn đã
tăng khá nhanh trong giai đoạn từ 1993-1999 và tiếp tục phát triển với tốc độ
nhanh từ năm 2000 trở lại đây. Điều đó cho thấy vai trò của cây bạch đàn rất
quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng ở nước ta trong những năm qua, đồng
thời loài cây này cũng là nguồn nguyên liệu chủ yếu phục vụ ngành công
nghiệp giấy sợi và ván nhân tạo, đóng góp không nhỏ vào sự phát triển của
nền kinh tế quốc dân.
1.3. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật
1.3.1. Lignin
Lignin được tìm thấy trong hầu hết những cây có mạch, chúng nằm xen
kẽ giữa các tế bào, bên trong tế bào và trong thành tế bào. Nó có chức năng
điều khiển sự vận chuyển các chất trong thực vật (một phần tham gia vào việc
giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh sự vận chuyển của
chất lỏng), cho phép cây lớn lên và cạnh tranh để giành ánh sáng mặt trời.
Trong thiên nhiên, lignin có khả năng chống chịu lại sự thoái hóa và
được gắn kết với nhau một cách phức tạp nhờ những liên kết hóa học bền
vững. Nó thực sự không chỉ là một hợp chất mà bao gồm rất nhiều hợp chất.
Đó là những polymer ba chiều, phức tạp và vô định hình. Chúng có một cấu
trúc chung là một vòng benzen với một đuôi gồm 3 cacbon. Cấu trúc tự nhiên
của lignin quá phức tạp đến nỗi không một cấu trúc nào có thể được mô tả
một cách đầy đủ và ước tính trọng lượng phân tử của chúng khoảng 15.000
kDa hoặc nhiều hơn [12].
Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở.
Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu
trúc gỗ. Lignin là các phức hợp dị polymer thơm và hiếm, được tổng hợp từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol. Ba loại đơn phân này phân biệt