TRƯỜNG
KHOA…………………….
Đề tài
Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa
enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ
chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
1
Mục lục
MỞ ĐẦU 3
Đặt vấn đề 3
Chương 2 5
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
Giới thiệu chung về ca cao 5
Sơ lược về cây ca cao 5
CHƯƠNG 3 21
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
Chương 4 32
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt
hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt
ca cao 32
Chương 5 70
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70
2
Chương 1
MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Xã hội càng phát triển thì nhu cầu của con người ngày càng tăng. Các sản phẩm cao cấp
cũng ngày càng được sử dụng nhiều hơn, trong đó các sản phẩm từ ca cao ngày càng phổ
biến hơn.
Từ ca cao, người ta có thể chế biến ra rất nhiều loại sản phẩm như: bánh, kẹo nhân

2009).
Hiện nay, ca cao được chia làm 3 nhóm chính, bao gồm: Criollo, Forastero và Trinitario.
2.1.1. Thành phần hóa học của quả và hạt ca cao
Nước, chất béo (bơ ca cao), carbohydrates, nitrogen, acid hữu cơ, mối khoáng,…Các
thành phần này sẽ có hàm lượng khác nhau ở chất nhầy, vỏ hạt và thịt hạt.
- Chất nhầy (thịt quả) có hàm lượng nước và đường cao nhất, ngoài ra còn có acid
citric làm cho pH của thịt quả luôn ở 3,5.
- Vỏ hạt có hàm lượng carbohydrates cao
- Thịt hạt có hàm lượng bơ ca cao rất cao, vỏ hạt có một ít và chất nhầy không có.
5
Hình 2.1 : Thịt quả ca cao
Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi
Thành phần Chất nhầy Vỏ hạt Phôi nhũ
Nước
Chất béo
(Bơ Ca cao)
Carbohydrate
Cellulose
Tinh bột
Pentosans
Sucrose
Glucose + Fructose
Nitrogen
Protein
Theobromine
Enzyme
Polyphenols
84,5
_
_

6
Acid hữu cơ
Citric & acetic, oxalic
Muối khoáng
Tổng số
0,7
0,8
100,0
_
8,2
100,0
0,6
2,6
100,0
(Nguồn: F. Hardy. Trích từ Phạm Chí Thông, 1999)
Theo Dr. Emile Cros, 1999 thì trong lớp cơm nhầy chứa khoảng 82% – 87% là nước, 10%
– 15 % đường, acid citric 1% – 3 %, protein 0,6%, pH ban đầu của lớp cơm nhầy vào
khoảng 3,6. Các thành phần này là cơ chất thích hợp cho hoạt động của các enzyme
protease, invertase và pectinase.
Với các thành phần trên thì việc ứng dụng các enzyme (pectinase, protease, invertase) phù
hợp với cơ chất có trong thành phần của lớp thịt quả (lớp cơm nhầy) là hướng đi chính
của đề tài.
2.1.2. Sơ chế hạt ca cao
 Thu hoạch quả cacao
Trong thu hoạch cần phải hái trái chín, vì nếu chưa chín hạt
trong trái khó bóc ra, khó ủ, tỉ lệ hạt tím và xám cao, năng
xuất cacao thô giảm nhiều. Nhưng trái chín lâu trên cây thì
trái dễ bị sâu bệnh, côn trùng phá hoại và bản thân trái cacao
bị chín rục, thối rữa và hạt trong trái sẽ nảy mầm (Theo Phạm
Trí Thông, năm 1999).

C để tiêu diệt sức sống
của hạt (tránh hạt nảy mầm), nhiệt độ này sẽ thuận lợi cho các phản ứng sinh hóa trong tế
bào xảy ra nhanh hơn.
Thời gian lên men từ 5 – 7 ngày đối với gống Forastero, Trinitario tùy điều kiện
thời tiết của từng vùng. Nếu lên men ngắn quá thì quá trình sinh hóa chưa xảy ra hoàn
thiện, nếu lên men quá dài thì sự phân hủy đối với một số chất hữu cơ trong hạt xảy ra
mãnh liệt và tạo ra các sản phẩm gây mùi khó chịu như: phân hủy protein thành NH
3
, ôxy
hóa các acid béo không no thành các aldehyt có mùi át mùi đặc trưng của ca cao, các phản
ứng tạo ester với các mùi không mong muốn…(Theo Bernard W.Minific, C. C., F.R.I.C,
năm 1980)
Mức độ thông khí thích hợp: thông thường quá trình lên men yếm khí xảy ra đối
với hạt cacao bình thường (không được lưu quả) là 32 – 48 giờ, và đối với hạt đã làm
giảm hàm lượng nước (lưu quả 9 ngày) thì sau 24 – 32 giờ và tiếp theo sau đó là quá trình
lên men hiếu khí (là giai đoạn cần không khí) tạo acid acetic. Như vậy, thời gian đảo cần
thiết đối với hạt bình thường (không được lưu quả) là 2 ngày 1 lần đối với hạt từ quả được
lưu 9 ngày là một ngày sau 48 giờ. (Theo Smilja, L., 2007)
Loại thùng ủ: Thùng ủ phải đảm bảo không có mùi vị lạ (mùi cao su, mùi xốp, ,
…), không bị acid ăn mòn, chất liệu thùng ủ không bị tác động bởi acid và cồn. Thùng ủ
còn phải có tác dụng dễ thoát dịch nhớt, giữ được nhiệt độ.
Khối lượng và độ cao khối hạt: Khối lượng hạt để đạt được kết quả lên men tốt là
từ 50 kg hạt tươi trở lên, độ cao khối hạt trong ủ lên men ở khối lượng vừa và nhỏ là
không quá 40 cm. Với khối lượng và độ vao này thì quá trình sinh hóa trong hạt sẽ xảy ra
9
một cách triệt để và theo xu hướng tốt (Theo Sterling S. Thompson, K. B. M., Alex
S.lopez, năm 2001)
• Cơ chế của quá trình lên men
- Sự lên men của lớp cơm nhầy ca cao Lớp cơm nhầy chứa một trữ lượng
đường cao (khoảng 15 % - 20 %) và do sự có mặt của acid citric tạo nên độ pH của lớp

0
C, sau đó
giảm xuống. Sau 6 ngày ủ nhiệt độ đạt cỡ 48
0
C.
Khi ủ một khối lượng lớn, nhiệt độ trong lòng khối ủ tăng chậm hơn và tỉ số hạt
còn sống ở giữa khối còn cao, trong lúc đó ở lớp trên thì coi như không còn nữa. Vì vậy
trong quá trình ủ cần phải đảo trộn để làm cho khối ủ được thông khí giúp cho các hạt lên
men đều đặn. Ngoài ra còn giúp cho nấm mốc không nảy nở trên bề mặt và hạt không bị
quá khô.
10
(Theo Wood G.A.R, a. R. A. L., 2001).
Hình 2.7: Sự chuyển biến đường của cơm nhầy trong quá trình lên men
 Phơi, sấy ca cao:
Sau khi ủ ẩm độ của hạt ca cao khoảng 55 % (ẩm độ theo cơ sở ướt) và ẩm độ này
phải giảm xuống đến giá trị 6 – 7 % mới đảm bảo an toàn được, nhưng nếu hạ thấp ẩm độ
xuống dưới 5 % hạt ca cao sẽ rất giòn và dễ gãy (Theo Phạm Trí Thông, 1999).
Mục đích của việc phơi sấy: Ngoài việc hạ thấp ẩm độ nhằm ngăn ngừa nấm mốc
phát triển còn để hoàn tất các biến đổi hóa học xảy ra tiếp tục bên trong hạt sau thời kỳ
lên men để tạo hương vị đặc biệt cho ca cao (http://www.dost-bentre.gov.vn/chuyen-
muc/ung-dung-khoa-h oc-cong-nghe/289-qui-trinh-len-men-ht-ca-cao.html ).
Trong giai đoạn phơi (sấy) thì các phản ứng sinh hóa tiếp tục xảy ra (dưới tác động
của các enzyme được sinh ra trong quá trình lên men), trong đó đặc biệt là các phản ứng
phân hủy protein thành các amino acid, phân hủy tinh bột thành đường và các phản ứng
11
oxy hóa polyphenol tạo màu nâu và các tền hương vị chocolate trong nhân hạt ca cao
(Theo Phan Thanh Bình, 2009).
Hạt được ủ và phơi sấy tốt sẽ có màu tím nhạt và màu nâu chocolate. Khi bóp
mạnh bằng tay sẽ nghe âm thanh rắc rắc và dễ nghiền thành bột.
 Bảo quản

Các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng va
chạm với nhau ở vị trí xảy ra phản ứng và phải ở trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hoá các
phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho chúng. Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt
hóa. Chất xúc tác nói chung và xúc tác enzyme đều có khả năng làm giảm năng lượng
hoạt hóa mà phản ứng yêu cầu bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian
mà tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng nhỏ hơn trường hợp không có chất xúc tác
(Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, năm 1998).
Sự tạo thành phức ES và biến đổi phức này thành sản phẩm P trải qua 3 giai đoạn
sau:
E + S  ES  P +E.
- Trong giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo
thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng
lượng hoạt hóa thấp.
13
- Trong giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và
phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này. Kết quả là làm cho cơ chất được
hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn.
- Trong giai đoạn thứ ba: Sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng
dưới dạng tự do.
Trong quá trình tác dụng enzyme thể hiện tính đặc hiệu cao.
2.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme
- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng bậc nhất
phụ thuộc vào nồng độ enzyme.
Đường biểu diễn có dạng sau: Khi thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng, vận
tốc tăng. Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận
tốc không thay đổi.
(Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, năm 1998).
Hình 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng
V: Vận tốc phản ứng
E: Nồng độ enzyme

chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme.
2.2.2. Enzyme chủ yếu trong quá trình lên men ca cao
Chất lượng hạt ca cao được hình thành nên bởi các chất hóa học (tiền chất) để tạo
thành hương vị đặc trưng cho chocolate. Các chất hóa học này sinh ra trong quá trình lên
men, phơi (sấy) và hoàn thiện dần trong quá trình bảo quản hạt. Tác động của enzyme vào
các phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men và phơi sấy sẽ làm tăng tốc độ phản ứng,
làm tăng hiệu quả của các phản ứng và từ đó tạo ra nhiều tiền chất chocolate và làm tăng
chất lượng sản phẩm.
Tác động của các enzyme trong quá trình lên men ca cao (Theo Phan Thanh Bình,
2009):
- Giai đoạn đầu, các enzyme pectinase sẽ tác động vào các phân tử pectin làm
gãy các liên kết và tạo thành các phân tử nhỏ hơn làm cho lớp dịch nhầy rữa ra và thoát
bớt. Trong giai đoạn này enzyme cellulase cũng có tác dụng để phân cắt các sợi cellulose
nhằm làm cho lớp nhầy nhanh phân hủy.
- Giai đoạn tiếp theo, các enzyme phân hủy như: invertase, β – glocodase để
tạo nên nguyên liệu cho phản ứng tạo rượu. Enzyme invertase trong phần cơm nhầy hoạt
động mạnh phân hủy các đường không khử thành đường khử, cơ chất cho phản ứng tạo
màu Maillar (phản ứng giữa acid amin và đường khử).
- Giai đoạn tiếp theo, khi có không khí các enzyme protease, amylase,
glycosidase và polyphenol oxydase, lactatdehydrogenase, aldehydehydrogenase sẽ hoạt
16
động thủy phân các chất tương ứng tạo nên các tiền chất cũng như các chất tạo hương của
sản phẩm.
Enzyme polyphenol oxydase, peroxidase đã xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử
để tạo nên các tiền hương vị chocolate và tiền chất tạo màu. Enzyme carboxypeptide phân
hủy peptid thành các oligopeptid và các amino acid tự do.
- Giai đoạn cuối quá trình lên men và trong quá trình phơi, các acid hình
thành sẽ dịch chuyển từ lớp nhớt vào trong nhân và tác động đến các tế bào chứa
polyphenol để giải phóng các polyphenol và dưới tác dụng của enzyme polyphenol
oxydase sẽ oxy hóa để tạo thành các chất màu có trong hạt ca cao.

0
C
 Enzyme polygalacturonase (PG)
Enzyme polygalacturonase phân cắt liên kết glucozit 1,4 trong mạch pectin,tạo ra
acid galacturonic
18
(Ashraf, F., 1993)
Hình 2.11. Hoạt động thủy phân của enzyme polygalacturonase
Nhiệt độ tối thích của PG là 40
0
C – 50
0
C, pH tối thích là 4 – 4,5.
- Có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau: polymethyl
galacturonase tác dụng chủ yếu lên các este metylic của các acid polygalacturonic. Các
enzyme này được chia thành hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glucozit bị cắt đứt dưới
sự xúc tác của enzyme ở đầu hay giữa mạch.
+ Endoglucozidase – polymetylgalacturonase I: xúc tác sự thủy phân các liên kết
glucozit nội mạch ở các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao.
+ Exo – glucozidase – polymetylgalacturonase III: xúc tác sự thủy phân các liên
kết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu
từ đường không khử.
- Polygalacturonase là các enzyme có tác dụng chủ yếu lên các acid pectic
(các acid polygalacturonic không bị este hóa) và acid pectinic (các acid polygalacturonic
bị este hóa ở mức độ thấp). Các enzyme này cũng được chia làm hai nhóm nhờ vào vị trí
liên kết glucozit bị cắt đứt:
+ Endo - glucozidase – polygalacturonase II: xúc tác sự thủy phân các liên kết
glucozit ở giữa mạch của các phân tử acid pectic hoặc acid pectinic, các enzyme này tác
dụng ở vị trí liên kết đầu nhóm carboxyl tự do.
19

công nghệ sinh học Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Đaklak.
Thời gian tiến hành thí nghiệm: từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2010.
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu là dịch cơm nhầy của quả ca cao giống forastero hái từ vườn kinh
doanh của Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Daklak.
Độ chín của quả ban đầu dùng cho các thí nghiệm là quả có màu sắc vàng trên toàn
bộ đường rãnh quả hoặc trên cả bề mặt quả từ 1/2 trở xuống.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
Thí nghiệm của đề tài gồm 3 nội dung chính, mỗi nội dung có vật liệu nghiên cứu
riêng:
3.2.1. Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Nội dung 1: sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L (Novozyme).
Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm enzyme chứa enzyme pectinase, enzyme
pectolytic, protease, cellulase (chủ yếu là polygalacturonase) được chiết xuất từ 3 vi
khuẩn chủ yếu là Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei và Aspergillus niger.
Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm enzyme dạng lỏng, có màu nâu, mùi nhẹ của sản phẩm
lên men, dễ tan trong nước, pH hoạt động từ 3 – 6, pH tối ưu là 4,7 – 5,2. Bảo quản ở 0 –
10
0
C (32
0
F – 50
0
F), nhiệt độ hoạt động là 10
0
C (50
0
F) – 57
0

3.3. Bố trí thí nghiệm
3.3.1. Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Trong nội dung 1 ta có 2 thí nghiệm:
3.3.1.1. Thí nghiệm 1: Xác định điều kiện pH:
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại.
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 1
Công
thức
pH Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
3,5
4,5
5,5
6,5
30 ppm 650 ml 19,5 µml
22
3.3.1.2. Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện nhiệt độ
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35
0
C, 40
0

30 ppm 650 ml 19,5 µml
Ở mỗi công thức của thí nghiệm 1 và 2 ta có một mẫu đối chứng (không cho
enzyme) và một mẫu thí nghiệm (có bổ sung enzyme). Mỗi mẫu thí nghiệm cần 650 ml
dịch cơm nhầy của hạt ca cao.
Tỉ lệ enzyme sử dụng (30 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với
mỗi mẫu thí nghiệm cần 19,5 µml enzyme.
3.3.2. Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme protease
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Trong nội dung 2 ta cũng có 2 thí nghiệm:
3.3.2.1. Thí nghiệm 3: Xác định điều kiện pH
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại.
23
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm 3
Công
thức
pH Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
3,5
4,5
5,5
6,5
5 ppm 20 ml 0,1 µml

45
0
C
50
0
C
5 ppm 20 ml 0,1 µml
Ở mỗi công thức của thí nghiệm 3 và 4 ta có một mẫu đối chứng (không cho
enzyme) và một mẫu thí nghiệm (có bổ sung enzyme). Mỗi mẫu thí nghiệm cần 20 ml
dịch cơm nhầy của hạt ca cao.
Tỉ lệ enzyme sử dụng (5 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với
mỗi mẫu thí nghiệm cần 0,1 µml enzyme.
3.3.3. Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao:
3.3.3.1. Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện pH
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại.
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5
24
Công
thức
pH Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4

0
C
40
0
C
45
0
C
50
0
C
20 ppm 50 ml 1 µml
Ở mỗi công thức của thí nghiệm 5 và 6 ta có một mẫu đối chứng (không cho
enzyme) và một mẫu thí nghiệm (có bổ sung enzyme). Mỗi mẫu thí nghiệm cần 50 ml
dịch cơm nhầy của hạt ca cao.
Tỉ lệ enzyme sử dụng (20 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với
mỗi mẫu thí nghiệm cần 1 µml enzyme.
3.4. Chỉ tiêu và phương pháp xác định
3.4.1. Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
- Chỉ tiêu khảo sát: độ nhớt của dịch cơm nhầy.
- Ph ươ ng pháp nghiên c ứu: để xác định điều kiện nhiệt độ và pH để hoạt hóa
enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao ta sử dụng phương pháp đo
độ nhớt.
Theo dõi sự thay đổi độ nhớt của dịch cơm nhầy ca cao trong 60 phút. Sau 5 phút
đo độ nhớt của dịch cơm nhầy một lần.
25