Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm
Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm
gia cầm
gia cầm
Chẩn đoán huyết thanh học
Chẩn đoán huyết thanh học
•
Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)
Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)
•
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI)
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI)
Chẩn đoán virus học
Chẩn đoán virus học
•
Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng
Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng
•
Giám định virus bằng kỹ thuật PCR
Giám định virus bằng kỹ thuật PCR

Chẩn đoán virus học
Chẩn đoán virus học
Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm
Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm•
Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm
Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm

•
Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm
Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm
Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ
Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ
1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong
1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong
tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng
tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng
sinh tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu
sinh tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu
không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua
không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua
màng lọc 0,45μm hoặc 0,22μm.
màng lọc 0,45μm hoặc 0,22μm.

Phân lập virus trên phôi gà
Phân lập virus trên phôi gà•
Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm
Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm
vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi
vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi
•
Tiêm truyền trên phôi gà
Tiêm truyền trên phôi gà
•
Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên

•
Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía
Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía
buồng hơi
buồng hơi
•
Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm
Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm
10ml.
10ml.
•
Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm
Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm
-700 C
-700 C
•
Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu
Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu
âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần
âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần

Phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR
Bước1: chiết tách RAN từ bệnh phẩm bằng TRIZOL
Bước1: chiết tách RAN từ bệnh phẩm bằng TRIZOL
•
Cho 750 μl bệnh phẩm vào ống 1,5 ml
Cho 750 μl bệnh phẩm vào ống 1,5 ml
•
Thêm 250 μl TRIZOL.

Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời
Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời
gian 5 phút.
gian 5 phút.
•
Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ
Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ
10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.
10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.
•
Để khô ở nhiệt độ phòng .
Để khô ở nhiệt độ phòng .
•
Cho thêm 20 -60 μl nước.
Cho thêm 20 -60 μl nước.

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
)
)
Nguyên liệu
Nguyên liệu
:
:
•
Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog #210212)
Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog #210212)
gồm:
gồm:
•

Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μl.
Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μl.
•
Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút
Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
)
)
•
Máy lắc vortex.
Máy lắc vortex.
•
Máy nhân gen .
Máy nhân gen .
•
RNA của virus kiểm tra .
RNA của virus kiểm tra .
•
RNA đối chứng dương tính .
RNA đối chứng dương tính .
•
Primer forward và primer reverse .
Primer forward và primer reverse .
•
Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R.
Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R.

Các bước tiến hành phản ứng PCR (1 bước )

•
Th êm 2 μl RAN ki ểm tra v ào c ác ống A
Th êm 2 μl RAN ki ểm tra v ào c ác ống A
•2 μl RNA đối chứng H5N1 vào ống B
2 μl RNA đối chứng H5N1 vào ống B
•2 μl nước RNAse – Free vào ống C
2 μl nước RNAse – Free vào ống C
•
Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống .
Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống .

Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước )
Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước )
•
Đặt các ống trong máy nhân gen , đặt chương trình để
Đặt các ống trong máy nhân gen , đặt chương trình để
nhân gen .
nhân gen .
–
60
60
o
o
C trong 1 phút

94
94
0
0
C trong 30 giây (tách sợi )
C trong 30 giây (tách sợi )
–
50
50
0
0
C trong 30 giây (gắn primer)
C trong 30 giây (gắn primer)
–
72
72
0
0
C trong 1 phút
C trong 1 phút
–
Quay lại bước sáu 34 lần
Quay lại bước sáu 34 lần
–
72
72
0
0
C trong 10 phút
C trong 10 phút

Pipette và đầu tip 10 μl.
•
Thạch agarose 0,8% pha trong dung dịch TBE 1X( Invitrogen)
Thạch agarose 0,8% pha trong dung dịch TBE 1X( Invitrogen)
•
Dung d ịch TBE 1X
Dung d ịch TBE 1X
•
Ethidium bromide ( 10μg/ μl.)
Ethidium bromide ( 10μg/ μl.)
•
Dung dịch nạp thạch (GLB: 30% glycogen; 0,25% BPB v à 0,25%
Dung dịch nạp thạch (GLB: 30% glycogen; 0,25% BPB v à 0,25%
XC)
XC)
•
M arker trọng lượng phân tử ( thang DNA 100bp) (invitrogen)
M arker trọng lượng phân tử ( thang DNA 100bp) (invitrogen)
•
Ống microtube chứa sản phẩm PCR
Ống microtube chứa sản phẩm PCR
•
DNA đối chứng dương tính
DNA đối chứng dương tính

Các bước tiến hành
Các bước tiến hành
•
Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào
Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào

Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy
Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy
điện di ở điện thế 120V trong 30- 40 phút
điện di ở điện thế 120V trong 30- 40 phút
•
Đọc kết quả của marker và vạch của sản phẩm
Đọc kết quả của marker và vạch của sản phẩm
PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực
PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực
tím có bước sóng 302nm
tím có bước sóng 302nm
•
Ghi lại hình bằng máy ảnh
Ghi lại hình bằng máy ảnh

Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân
Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân
tử
tử
•
Thạch agarose 0,8% : 0,8 g thạch agarose trong
Thạch agarose 0,8% : 0,8 g thạch agarose trong
100ml dung dịch TBE 1X , đun nóng bằng water
100ml dung dịch TBE 1X , đun nóng bằng water
bath hoặc lò vi sóng đến khi hoà tan
bath hoặc lò vi sóng đến khi hoà tan
•
Ethidium Bromide (EB): sử dụng dung dịch gốc
Ethidium Bromide (EB): sử dụng dung dịch gốc
10μg/μl đổ vào thạch agarose để có hàm lượng