Download Luận văn Sử dụng kỹ thuật rflp khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau miễn phí
1.1. Đặt vấn đề Rhizoctonia solani (R. solani) là một trong những loài nấm gây hại điển hình, chúng có thể tồn tại lâu trong đất và gây thiệt hại khá nghiêm trọng đối với rất nhiều loài cây trồng khác nhau, đặc biệt chúng thường xuyên tấn công vào giai đoạn cây con và làm chết cây con hàng loạt khiến nhiều diện tích phải gieo trồng lại. R. solani không những gây bệnh đốm vằn phổ biến ở lúa mà còn gây hại cho nhiều cây trồng khác, từ các cây dài ngày như thông, cà phê, tiêu, sầu riêng đến các cây ngắn ngày như các cây họ đậu, bắp, các cây họ cải, v.v. kể cả trên cỏ dại như cỏ ống, cỏ lá tre, cỏ gừng, cỏ lá rộng, cỏ chỉ.
Phòng trừ bệnh do R. solani gây ra bằng biện pháp sử dụng giống kháng là rất khó bởi nấm này có phổ ký chủ quá rộng. Thêm vào đó sự biến động trong độc tính gây bệnh giữa các dòng phân lập của nấm này đã làm phức tạp đáng kể sự sàng lọc giống kháng. Mặt khác, việc thiếu kiến thức về cấu trúc di truyền của R. solani trong các quần thể tự nhiên đã làm cản trở sự phát triển các biện pháp phòng trừ an toàn cho môi truờng với tác nhân gây bệnh này. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như kĩ thuật PCR, RFLP, AFLP, Southern blot, sequence v.v. giúp cho quá trình nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm R. solani nhanh và chính xác hơn.
Trên thế giới, các kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của nấm R. solani. Ở nước ta, những nghiên cứu như vậy còn rất ít. Xuất phát từ tình hình trên, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau”. 1.2. Mục tiêu Cung cấp các thông tin về sự đa dạng di truyền trong các quần thể nấm R. solani làm dễ dàng cho việc phát triển các chiến lược phòng trừ bệnh do R. solani gây ra.
1.3. Yêu cầu của đề tài - Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm R. solani. - Ly trích DNA của các dòng nấm R. solani. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani. - Thực hiện phản ứng cắt đoạn rDNA-ITS đã được khuếch đại. - Đánh giá sự đa dạng của các dòng nấm R. solani dựa trên phân tích RFLP của vùng rDNA-ITS.
/tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-1879/
++ Ai muốn tải bản DOC Đầy Đủ thì Trả lời bài viết này, mình sẽ gửi Link download cho!Tóm tắt nội dung:
1
Phần I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Rhizoctonia solani (R. solani) là một trong những loài nấm gây hại điển hình,
chúng có thể tồn tại lâu trong đất và gây thiệt hại khá nghiêm trọng đối với rất nhiều
loài cây trồng khác nhau, đặc biệt chúng thường xuyên tấn công vào giai đoạn cây con
và làm chết cây con hàng loạt khiến nhiều diện tích phải gieo trồng lại.
R. solani không những gây bệnh đốm vằn phổ biến ở lúa mà còn gây hại cho
nhiều cây trồng khác, từ các cây dài ngày như thông, cà phê, tiêu, sầu riêng đến các
cây ngắn ngày như các cây họ đậu, bắp, các cây họ cải, v.v.. kể cả trên cỏ dại như cỏ
ống, cỏ lá tre, cỏ gừng, cỏ lá rộng, cỏ chỉ.
Phòng trừ bệnh do R. solani gây ra bằng biện pháp sử dụng giống kháng là rất
khó bởi nấm này có phổ ký chủ quá rộng. Thêm vào đó sự biến động trong độc tính
gây bệnh giữa các dòng phân lập của nấm này đã làm phức tạp đáng kể sự sàng lọc
giống kháng. Mặt khác, việc thiếu kiến thức về cấu trúc di truyền của R. solani trong
các quần thể tự nhiên đã làm cản trở sự phát triển các biện pháp phòng trừ an toàn cho
môi truờng với tác nhân gây bệnh này.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như
kĩ thuật PCR, RFLP, AFLP, Southern blot, sequence v.v.. giúp cho quá trình nghiên
cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm R. solani nhanh và chính xác hơn. Trên thế
giới, các kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về sự đa dạng
di truyền của nấm R. solani. Ở nước ta, những nghiên cứu như vậy còn rất ít.
Xuất phát từ tình hình trên, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh
Học, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, chúng tui đã thực hiện đề tài “Sử
dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani
phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau”.
1.2. Mục tiêu
Cung cấp các thông tin về sự đa dạng di truyền trong các quần thể nấm R. solani
làm dễ dàng cho việc phát triển các chiến lược phòng trừ bệnh do R. solani gây ra.
2
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm R. solani.
- Ly trích DNA của các dòng nấm R. solani.
- Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani.
- Thực hiện phản ứng cắt đoạn rDNA-ITS đã được khuếch đại.
- Đánh giá sự đa dạng của các dòng nấm R. solani dựa trên phân tích RFLP của
vùng rDNA-ITS.
1.4. Giới hạn của đề tài
Chỉ tiến hành cắt giới hạn với 3 enzyme cắt giới hạn và 9 dòng nấm đại diện.
3
Phần II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani
Nấm Rhizoctonia là một nhóm nấm lớn, đa dạng và phức tạp, phân bố khá rộng
và được chia thành nhiều nhóm nấm khác nhau. Giai đoạn hữu tính liên quan đến 3
giống: Thanatephorus (giai đoạn vô tính là Rhizoctonia solani Kuhn), Ceratobasidium
(giai đoạn vô tính là loài Rhizoctonia hai nhân), và Waitea (giai đoạn vô tính là loài R.
zeae Voorhees, R. oryzae Ryker và Gooch và những loài khác) (Carling và Sumner,
1992).
Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi
imperfecti. Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris (Frank)
Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, là nấm kí sinh không chuyên tính, có phổ
kí chủ rộng.
2.1.1. Đặc điểm hình thái
Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn non
không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa bào, có
đường kính từ 8 - 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi thắt lại,
và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).
R. solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate
hyphae), và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Phan Minh Sang, 2003).
Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất thay đổi.
Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen, nâu
xám, trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, ít khi hình cầu, đáy phẳng, bề
mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976). Đường kính hạch nấm từ 1-
6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to (Ou, 1983).
Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi lên do tế bào phía
ngoài hạch trở nên rỗng (dẫn theo Phạm Minh Sang, 2003).
Bào tử hậu ít gặp, chỉ phát sinh khi có ẩm độ rất cao. Sinh sản hữu tính tạo đảm
đơn bào, không màu, hình bầu dục, có từ 2 - 4 bào tử đảm, hình trứng hay hình bầu
dục dẹt. Ở nước ta chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề,
4
1998). Bào tử đảm không có khả năng tồn tại lâu nhưng có vai trò lớn trong sự biến
đổi di truyền của nấm (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005).
2.1.2. Đặc điểm sinh lý
Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm sinh trưởng thích hợp ở nhiệt
độ 28 – 32oC, ở nhiệt độ dưới 10oC và cao hơn 38oC nấm ngừng sinh trưởng. Hạch
nấm hình thành nhiều ở nhiệt độ 30 – 32oC. Khi nhiệt độ quá thấp (12oC) và quá cao
(40
oC), nấm không hình thành hạch. Nấm có thể phát triển được trong phạm vi pH
rộng từ 3,4 - 9,2, thích hợp nhất ở độ pH 6 - 7.
Hạch nấm hình thành nhiều nhất ở ngoài ánh sáng và khi nhiệt độ môi trường
giảm đột ngột. Các hạch nấm này nảy mầm ở nhiệt độ 16 – 30oC, nhiệt độ tối ưu 28 –
30
oC. Ẩm độ tương đối 95 - 96% thích hợp cho hạch nấm nảy nầm (Ou, 1983). Hạch
nấm có kích thước càng lớn, số lượng hạch càng nhiều thì độc tính càng cao. Hạch
nấm có thể sống được 4 - 5 tháng trong đất khô, 7 tháng trong điều kiện ngập nước
(Đường Hồng Dật, 1976).
R. solani có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng (20 - 300C) từ 6 - 12 tháng trong
ống nghiệm chứa môi trường PDA (potato dextrose agar), PDYA (potato dextrose
yeast extract agar) hay các vật liệu cây trồng tự nhiên. Nấm có thể tồn trữ trên môi
trường hạt đậu khô đến 9 năm mà không làm mất tính độc. Tính độc của chúng bị mất
trong vòng 2 - 3 tháng khi tồn trữ ở nhiệt độ từ 0 - 70C (Carling và Sumner, 1992).
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy
Nấm R. solani không đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng chuyên biệt, nó có thể phát
triển tốt trên nhiều loại môi trường khác nhau. Hạch nấm thường hình thành sau 3-4
ngày nuôi cấy. Hạch nấm hình thành nhiều hay ít, có hình thành hay không phụ thuộc
vào môi trường nuôi cấy, điều kiện ngoại cảnh cũng như phụ thuộc vào các nhóm nấm
khác nhau. Hạch nấm thường mọc rải rác khắp đĩa, có loài mọc rời, cũng có loài mọc
thành từng mảng liên kết với nhau. Tuy nhiên cũng có loài không hình thành hạch
(Nguyễn Minh Nguyệt, 2003). Hạch nấm mọc trên môi trường nuôi cấy có kích thước
lớn hơn so với hạch nấm mọc trên cây kí chủ tự nhiên (Ou, 1983).
2.2. Điều kiện phát sinh bệnh
R. solani xâm nhập ký chủ và gây bệnh phát triển nhất trong điều kiện nhiệt độ tương
đối cao (25 - 300C), ẩm độ 90% đến bão hòa, mưa liên tục. Kỹ thuật canh tác: mật độ
cây, chăm sóc, phân bón, thủy lợi,…đều liên quan đến việc phát sinh bệnh.
5
Nấm ...
