Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 2
1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người 2
1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người 2
1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh 3
1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam 4
1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh 4
1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh 6
1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) 7
1.2.1. Giới thiệu chung 7
1.2.2. Tiến trình hoạt động của 2-DE 7
1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE 9
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE 9
1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) 10
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15
2.1.2. Hóa chất 15
2.1.3. Thiết bị 16
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh 16
2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau 16
2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford 17
2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) 18
2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 19
2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin 20
2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS 20
2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8 21
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23
3.2. Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được 24
3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford 25
3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt 27
3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp 30
3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein 32
3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE 34
3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS 36
3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện 37
3.9.1. Haptoglobin 37
3.9.2. Apolipoprotein A (Apo) 38
3.9.3. Transthyretin (TTR) 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
MỞĐẦU
Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay. Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉở số lượng rất lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng. Trong khi một số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%-10%)…, thì ngược lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số. Những khác biệt rất lớn về nồng độ này cùng với sự hạn chếvề mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định lượng vàđịnh tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn vàít được chúý trong một thời gian dài. Song gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy vàđộ chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại với hàm lượng tới fg/mL. Một số thành phần protein hàm lượng thấp trong huyết thanh đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn.
Một trong những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này là nghiên cứu phân đoạn protein bền nhiệt trong huyết thanh. Mặc dù chưa cóđược nhiều thành tựu lớn, nhưng những kết quả mới công bố gần đây cũng đã gợi ý những phương pháp thu nhận, phân tích và nhận dạng có hiệu quả các protein huyết thanh bền nhiệt, đồng thời cũng chứng minh được có những mối liên hệ nhất định giữa sự biến đổi tính bền nhiệt của các protein này với các quá trình bệnh lý, đặc biệt làđái tháo đường và ung thư. Các nghiên cứu trên hệ protein bền nhiệt này hiện còn rất mới, rất tiềm năng và hứa hẹn sẽ thu được nhiều thành tựu quan trọng và cóý nghĩa trong nghiên cứu sinh - y học.
Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tui sử dụng phương pháp điện di hai chiều 2-DE và khảo sát một sốđiều kiện thực nghiệm có liên quan để thực hiện đề tài“Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều”với mục tiêu thu nhận, phân tách và bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh người Việt Nam, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trên hệ protein này, đặc biệt là trên các mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh và tìm kiếm các ứng viên chỉ thị bệnh đặc hiệu.
Chương 1. TỔNGQUANTÀILIỆU
1.1. TỔNGQUANVỀHỆPROTEINHUYẾTTHANHNGƯỜI
1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người
Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi máu chống đông đãđược loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào. Huyết tương là thành phần quan trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm 55-60% thể tích máu[44].
Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ các thành phần tế bào và các yếu tốđông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ các yếu tốđông máu. Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác.... Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực hiện các vai trò rất đa dạng nhưđông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể.
Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính hữu ích cho các nghiên cứu proteomics. Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8].
1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người
Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9].
Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng số(hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein, ... [30]. Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hay rất thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do nhiễm vi sinh vật, .... Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát hiện chúng.
OQG1f4YyqGIq42h
