Download miễn phí Luận văn Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh



Hoạt tính đối kháng của nấm sợi phân lập từRNM huyện Cần Giờvới các
VSV kiểm định ởcác mức độmạnh yếu khác nhau.
Có 134 / 312 chủng nấm sợi RNM (chiếm 42,9%) có khảnăng chống lại các
VK gram dương, trong đó có 16 / 134 chủng (chiếm 11,9%) thểhiện hoạt tính rất
mạnh.
Có 39/ 312 chủng nấm sợi RNM (chiếm 12,5%) có khảnăng kháng lại các VK
gram âm, trong đó có 2 chủng (chiếm0,5 %) thểhiện họat tính mạnh.
Có 39/312 chủng (chiếm 12,5%) có khảnăng kháng cảVK gram dương lẫn
VK gram âm.
Các chủng nấm sợi phân lập từRNM có tiềm năng sinh chất kháng sinh cao,
đặt biệt là kháng sinh kháng Bacillus subtilis, một lọai trực khuẩn cỏkhô. Hoạt tính
kháng sinh đã giúp các chủng nấm sợi thích nghi và có thể đấu tranh sinh học đểtồn
tại trong RNM. Các chủng nấm sợi này sẽ được tiếp tục nghiên cứu, nhằm tìm ra các
chủng có ý nghĩa thực tiễn đối với cây trồng nói riêng và ởRNM nói chung.


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-10-31-luan_van_khao_sat_kha_nang_sinh_khang_sinh_cua_cac.e6BPn9Bfi4.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-42853/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

ox (nuôi cấy, giữ giống nấm sợi kiểm định)
[8].
Glucôza 20,0g;
NaNO3 3,5g;
KH2 PO4 1,5g;
MgSO4.7 H2O 0,5g;
KCl 0,5g;
FeSO4.7 H2O 0,1g;
Thạch 20,0g;
Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0;
( thêm 0,5g chloramphenicol khi phân lập)
- MT 2: Môi trường Glucose Yeast Extract Agar (môi trường nuôi cấy và giữ
giống nấm sợi RNM- môi trường YEA) [46].
Glucôza 20,0g
Cao nấm men 4,0g
Thạch 20,0g
Nước biển 1000ml, pH 5,5 – 6,0.
- MT 3: Môi trường D (môi trường nuôi cấy nấm sợi RNM) [46].
Glucôza 10,0g;
Peptôn 2,0g;
KH2 PO4 5,0g;
MgSO4.7 H2O 0,5g;
Thạch 20,0g;
Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0
2.1.4.2.Môi trường phân loại nấm sợi:
- MT 4:Môi trường Potato Glucose Aga r(môi trường PGA- môi trường nuôi
cấy nấm sợi gây bệnh ở cây trồng) [8].
Khoai tây 250,0g
Glucôza 20,0g
Thạch 15,0g (nếu làm môi trường đặc)
Nước cất 1000ml.
- Cách chế dịch khoai tây:
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 250g, thái nhỏ, thêm 500ml nước, đun sôi, nhỏ
lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong.
- MT 5:Môi trường Malt Extract Agar (môi trường MEA- môi trường phân
loại nấm sợi)
Glucôza 20,0g;
Peptôn 1,0g;
Malt Extract 20,0g;
Thạch 20,0g;
Nước biển 1000 ml, pH = 5,5 - 6
- Môi trường YEA ( môi trường 2.1.4.1)
Nếu thử hoạt tính kháng sinh thì thay nước biển bằng nước cất
2.1.4.3. Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm men kiểm định [8].
-MT 6: Môi trường Hanxen .
Glucôza 50,0g;
Peptôn 10,0g;
KH2 PO4 3,0g;
MgSO4.7 H2O 2,0g;
Thạch 20,0g;
Nước cất 1000 ml, pH 5,5 – 6,0
2.1.4.4.Môi trường MPA nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định [16].
- MT 7: Môi trường MPA.
Peptôn 5,0g;
NaCl 5,0g;
Cao thịt 5,0g;
Thạch 20,0g,
Nước cất 1000ml; pH= 7,5.
2.1.4.5. Môi trường thử họat tính enzym ngoại bào [8], [46].
a. Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp cấy chấm điểm:
Dùng [MT1] để thử hoạt tính enzym ngoại bào như: xenlulaza, prôteaza,
amilaza dùng các cơ chất tương ứng là CMC, casein, tinh bột thay đường glucose với
hàm lượng tương đương.
b. Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp đục lỗ:
Dùng [MT 2, MT 3] để thử hoạt tính enzym ngoại bào, thành phần môi trường
tương tự nhưng không có agar.
MT8:Môi trường khoáng (phát hiện khả năng phân giải dầu) [19].
KH2 PO4 0,3g;
MgSO4 0,4g;
KNO3 3,0g;
Na2 HPO4 0,7g;
Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0;
dầu DO hay dầu thô 5 %
Lưu ý: Các môi trường trên trước khi đem sử dụng đều được thanh trùng ở 1atm
trong 30 phút.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương phápVSV
2.2.1.1.Phương pháp lấy mẫu [19].
Các mẫu được thu ngẫu nhiên khi thủy triều vừa rút tại các rừng già cách biển
2 km.Các điểm lấy mẫu cách nhau 200 m. Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5-10
cm, thân cây tươi, thân cây mục, lá tươi trên cành, lá mục trên mặt đất. Khu vực lấy
mẫu là vùng nước lợ có độ mặn từ 12 - 18 0 / 00, nhiệt độ trung bình khoảng 25- 280C,
độ ẩm 79- 87 %, pH dao động trong khoảng 4- 4,5.
Mẫu bao gồm:lá vàng vừa rụng , lá rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên
cây, thân cành chết đang bị phân giải trên mặt bùn, đất bề mặt.
Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng, cắt khoảng 50g mẫu cho vào túi nilon vô
trùng bọc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu , ngày tháng , bảo quản trong thùng
nước đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và giữ ở tủ giống 40 C .Các mẫu được phân
lập ngay không giữ quá 48h.
2.2.1.2.Phương pháp phân lập [9], [46].
Lấy mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo F.Uyenco (1988)
a.Lấy mẫu và pha loãng mẫu.
Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ .
Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230vòng/ phút. Túi
lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ phần dịch hơi đục chảy ra bên ngòai.
Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1.
Lắc đều, rồi hút 1ml dd 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng
ta đựợc dung dịch pha loãng nồng độ 10-2.
Tiếp tục pha lõang liên tiếp như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5,
10-6.
b- Cấy mẫu
Nhỏ 0,1ml dung dịch ở mỗi nồng độ lên dĩa chứa môi trường.
Dùng que trang trải lên khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó trải tiếp 2
đĩa tiếp theo.
c- Ủ mẫu
Úp đĩa pêtri xuống, dùng báo gói lại, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày.
Chọn khuẩn lạc riêng lẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.
d- Làm thuần
Lấy 1 mẫu khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước biển vô trùng, trải
lên đĩa lần 2, nếu thuần nhất 1 khuẩn lạc đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính
hiển vi đều có 1 dạng tế bào thì đã thuần, ta cấy sang 3 ống thạch nghiêng để bảo
quản ngắn hạn và nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa .
2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi.
2.2.2.1.Quan sát đại thể nấm sợi.
-Phương pháp nuôi cấy tạo khuẩn lạc khổng lồ:
- Cho vào ống thạch nghiêng (đã cấy chủng nấm sợi thuần khiết) 5ml nước
biển vô trùng, tạo dung dịch huyền phù.
- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm
vào mặt thạch ở giữa đĩa pêtri. Quan sát sự hình thành và phát triển của
khuẩn lạc hằng ngày theo các đặc điểm sau.
+ Đo kích thước khuẩn lạc.
+ Quan sát hình dạng khuẩn lạc, màu sắc mặt phải, mặt trái của KL, màu sắc
của môi trường, dạng mép KL, chất tiết trên bề mặt KL, mùi…
2.2.2.2.Quan sát vi thể nấm sợi [9], [10].
Phuơng pháp làm phòng ẩm nuôi cấy nấm để quan sát của J.T.Dunean.
- Chuẩn bị môi trường thích hợp ( PDA, MEA, YEA) đổ 1 lớp thật mỏng
khoảng 1mm trên bề mặt các đĩa petri. Khi thạch đã đông hoàn toàn thì dùng
dao vô trùng cắt thành từng mẩu hình vuông, diện tích 1cm2 .
- Chuẩn bị các đĩa pêtri sạch, phiến kính , lá kính, bông thấm nước (hay giấy
thấm) nước cất, tất cả đều được vô trùng (sấy ở nhiệt độ 1600C, trong 1 giờ).
- Đặt 1 khối thạch lên phiến kính. Cấy 1 ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối
thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp pêtri có sẳn giấy thấm (bông) vô trùng
được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 3-4
ngày.
- Sau 3- 4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên 1 phiến kính sạch có bề mặt
thuốc nhuộm. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính,
nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta đựơc tiêu bản thứ 2. Quan sát
dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm:
+ Giá bào tử, các thể bọng, thể bình.
+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn.
+ Màu sắc, kính thước bào tử, có gai hay không có gai.
Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đaị 400- 1000 lần.
2.2.3.Các phương pháp hóa sinh.
2.2.3.1. Kiểm tra họat tính enzym ngoại bào của nấm sợi [9].
Bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
a. Nguyên tắc.
Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm
sợi phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh khuẩn lạc.
b. Thực hiện.
 Phương pháp cấy chấm điểm
- Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các môi trường thích hợp (MT 1
với cơ chất tương ứng).
- Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp
pêtri) lên môi trường thử họat tính tương ứng. ...

---