Download miễn phí Đề tài Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM)



Mục lục
Trang
Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06 2
Danh sách cán bộ tham gia 3
Danh sách các đon vị tham gia, phối hợp 5
tóm tắt Báo cáo 6
Những từ viết tắt 13
Lời nói đầu 14
Chương I Tổng quan tài liệu 24
1.1. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 24
1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 24
1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 24
1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam 25
1.1.2. Tóm lược về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng 26
1.1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 27
1.1.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P. multocida 27
1.1.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn 27
1.1.3.3. Tính chất bắt màu của vi khuẩn. 28
1.1.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P. multocida 28
1.1.3.5. Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida 31
1.1.3.6. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 32
1.1.3.7. Độc tố của Pasteurella multocida 32
1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 33
1.1.4.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen). 33
1.1.4.2. Kháng nguyên thân (O) ư Somatic antigen. 34
1.1.5. Các type huyết thanh học của P. multocida. 35
1.2. Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella
spp gây ra ở gia cầm. 37
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella. 37
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước. 39
1.2.3. Đặc điểm của Salmonella. 41
1.2.4. Tình trạng ngộ độcthức ăn do Salmonella. 41
1.2.5. Biện pháp phòng bệnh. 42
1.2.6. vắcưxin chống Salmonella cho gà 43
1.2.6.1. Một số loại vaccine chống Salmonella 43
1.2.6.2. Sơ lược về kháng nguyên roi của S. typhimurium 44
1.2.6.3. Kháng nguyên roi của Salmonella typhimurium có
khả năng bảo hộ cho gà chống Salmonella. 45
1.2.6.4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin 46
1.3. Bệnh Lở mồm Long móng 47
1.3.1. Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình
nghiên cứu về bệnh trong, ngoài nước. 47
1.3.1.1. Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh
trên thế giới và ở Việt Nam. 47
1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới. 49
1.3.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trong nước. 51
1.3.2. Vi rút gây bệnh LMLM. 52
1.3.2.1. Hình thái học. 52
1.3.2.2. Sức đề kháng của vi rút. 52
1.3.2.3. Đặc tính nuôi cấy. 52
1.3.3. Các phương pháp chẩn đoán. 53
1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng. 53
1.3.3.2. Đại cương về chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. 53
1.3.3.3. Chẩn đoán huyết thanh học. 54
1.3.3.3.1. Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 54
1.3.3.3.2. Phản ứng trung hoà vi rút. 55
1.3.3.3.3. Phản ứng ELISA. 55
1.3.3.3.4. Các phản ứng huyết thanh học khác 56
1.3.3.4. Chẩn đoán vi rút học. 56
1.3.3.5. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RTưPCR. 56
Chương II: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 58
A. Nguyên liệu 58
2.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng
chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lượng cao. 58
2.1.1. Động vật thí nghiệm. 58
2.1.2. Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng. 58
2.1.3. công cụ máy móc thí nghiệm. 58
2.1.4. Môi trường, hoá chất 58
2.2. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và
S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 59
2.2.1. Động vật và sản phẩm động vật. 59
2.2.2. Các loại môi trường thông thường. 59
2.2.3. Các loại môi trường chuyên biết. 60
2.2.4. Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác. 62
2.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và
S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 62
2.3.1. Chủng vi sinh vật. 62
2.3.2. Động vật. 62
2.3.3. Plasmid. 62
2.3.4. Môi trường nuôi cấy. 63
2.3.5 Các dung dịch. 63
2.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RTưPCR. 64
2.4.1. Bệnh phẩm. 64
2.4.2. Nguồn bệnh phẩm. 64
2.4.3. Dung dịch bảo quản bệnh phẩm. 64
2.4.4. Tế bào BHKư 21 và môi trường nuôi cấy tế bào. 65
2.4.5. Hoá chất, vật liệu và thiết bị để tiến hành phản ứng RTưPCR. 65
2.4.5.1. Mẫu ARN chuẩn. 65
2.4.5.2. Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RTư PCR. 65
2.4.5.3. Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho việc tách dòng (cloning). 65
2.4.5.4. Thiết bị, máy móc. 66
2.4.5.5. Các cặp mồi đặc hiệu với vi rút LMLM type O, A , C hay Asiaư1. 66
B. Phương pháp nghiên cứu 66
3.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ
huyết trùng trâu bò chất lượng cao. 66
3.1.1. Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu và sản xuất vacxin. 66
3.1.2. Xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hoá của vi
khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR. 67
3.1.3. Kiểm tra độc lực của vikhuẩn đối với chuột nhắt trắng. 69
3.1.4. Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn – Saponin. 71
3.1.5. Kiểm nghiệm vắc xin 72
3.1.5.1. Kiểm tra vô trùng vắc xin. 72
3.1.5.2 Kiểm tra an toàn vacxin 72
3.1.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin. 72
3.1.5.3.1. Kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thí nghiệm. 72
3.1.5.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vacxin đối với trâu, bò. 72
3.1.6. Phương pháp xử lý số liệu. 76
3.1.6.1. Phương pháp tính chỉ số miễn dịch. 76
3.1.6.2. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê. 76
3.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium
bằng công nghệ vi khuẩn. 77
3.2.1. Các phương pháp vi sinh vật học thông thường. 77
3.2.2. Các phương pháp sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin. 77
3.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh doS.enteritidis và S. typhimurium
bằng vi khuẩn biến nạp. 78
3.3.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn. 78
3.3.2. Phương pháp tổng hợp chuỗi (PCR). 78
3.3.3. Xử lý ADN bằng enzym hạn chế. 78
3.3.4. Phản ứng nối ghép gen. 79
3.3.5. Biến nạp vào E. coli. 79
3.3.6. Tách chiết ADN plasmid từ E. coli. 80
3.3.7. Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp. 81
3.3.8. Biến nạp plasmid vào nấm men P. pastoris bằng xung điện. 82
3.3.9. Western Blot, ELISA. 83
3.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RTưPCR. 84
3.4.1. Các phương pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM của
Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế. 84
3.4.2. Phương pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm. 84
3.4.3. Phương pháp RTưPCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM. 86
3.4.3.1. Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô. 86
3.4.3.2. Tạo cADN bằng phản ứng sao chép ngược. 86
3.4.3.3. Phản ứng PCR. 86
3.4.3.5. Kiểm tra sản phẩm PCR. 87
3.4.4. Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho serotype O
của vi rút gây bệnh LMLM phân lập tại Việt nam. 88
3.4.4.1. Lai sản phẩm PCR vào vectortách dòng pCRR2.1 và biến nạp
vào tế bào khả biến (competent E. coli cells). 88
3.4.4.2. Tách chiết Plasmid. 89
3.4.4.3. Cắt bằng enzym giới hạn. 89
3.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM. 90
3.4.5.1. Phương pháp nuôi tế bào BHKư21 (Baby Hamster Kidney ư 21). 90
3.4.5.2. Phương pháp tách tế bào bám dính. 90
3.4.5.3. Phương pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHKư21. 90
Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 92
4.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ
huyết trùng trâu bò chất lượng cao. 92
4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ
trâu bò chết của các địa phương. 92
4.1.2. Tính tương đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn P. multocida
chủng IR với thay mặt các chủng P. multocida phân lập được. 95
4.1.3. Kết quả xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả
năng sản sinh miễn dịch tốt nhất trên trâu bò. 96
4.1.4. Kết quả xác định công thứcbổ trợ thích hợp và theo dõi độ
dài miễn dịch của vắc xin keo phènưsaponin. 97
4.1.5. Kết quả chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phènư saponin chủng IR.98
4.1.6. Tính tương đồng kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida
chủng IR với các chủng P. multocida khác đang sử dụng chế vắc xin THT
trâu bò tại Việt Nam. 99
4.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium
bằng công nghệ vi khuẩn. 99
4.2.1. Kết quả điều tra một vài đặc điểm dịch tễ tại 4 cơ sở chăn
nuôi gà giống. 99
4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. 100
4.2.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn
Salmonella phân lập được. 102
4.2.4. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập
được trên chuột nhắt trắng. 104
4.2.5. Kết quả thử khả năng mọc của các chủng Salmonella trên
các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau. 105
4.2.6. Kết quả thử đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella 106
4.2.7. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập được 106
4.2.8. Kết quả xác định LD 50 của các chủng Salmonella phân lập được 107
4.2.9. Sản xuất thử nghiệm vacxin S.enteritidis và S. Typhimurium vô hoạt keo phèn 108
4.2.10. Kết quả thử thuần khiết vacxin 108
4.2.11. Kết quả thử vô trùng của vacxin 108
4.2.12. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trắng 109
4.2.13. Kết quả thử an toàn trên gà mái hậu bị 110
4.2.14. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 110
4.2.15. Kết quả thử nghiệm hiệu lực của vác xin trên gà 111
4.2.16. Thí nghiệm xác định liều sử dụng của vacxin 111
4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidisvà S. typhimuriumbằng vi khuẩn biến nạp 113
4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 113
4.3.1.1. Đưa gen vào vectơ pCR2.1 113
4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn 113
4.3.1.1.2.Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S.
typhimurium, S. enteritidis 114
4.3.1.1.3. Đưa sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 115
4.3.1.2. Đưa gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+) 119
4.3.1.3. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 120
4.3.2. Biểu hiện gen fliC3, gm3,sef14 trong nấm men P. pastoris 122
4.3.2.1. Nhân các gen bằng PCR 122
4.3.2.2. Đưa gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 123
4.3.2.3. Đưa gen vào vectơ biểu hiện pPIC9 123
4.3.2.4. Biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris 125
4.3.3. Thử đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3 126
4.3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC 126
4.3.3.2. Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng
nguyên toàn phần trên gà hậu bị 127
4.3.3.3. Western blot và ELISA 127
4.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp GM3 131
4.3.5. Nghiên cứu khả năng bảo hộ của protein tái tổ hợp Flic3 và Gm3 132
4.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RTưPCR 134
4.4.1. Khái quát tình hình dịchbệnh LMLM tại Việt Nam
trong vòng 5 năm trở lại đây thời gian gần đây 134
4.4.2. Diễn biến lâm sàngcủa bệnh trên bò và lợn 136
4.4.3. Thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm từ gia súc
nghi mắc bệnh 138
4.4.3.1. Thu thập bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 138
4.4.3.2. Vận chuyển bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139
4.4.3.3. Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139
4.4.4. Thiết lập phương pháp RT–PCR để phát hiện vi rút
gây bệnh LMLM bằng mẫu ARN đã biết 140
4.4.5. Chẩn đoán định type các mẫu bệnh phẩm thu thập tại tỉnh Qủang Trị 143
4.4.6. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi dùng
trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM. 145
4.4.7. Kết quả ứng dụng phương pháp RTưPCR để chẩn đoán định
typ vi rút LMLM từ các bệnh phẩm thu thập từ thực địa 147
4.4.8. Tách dòng và giải trình trình tự đoạn gene mã hoá cho
serotype O của vi rut LMLM thu thập tại tỉnh Qủang Trị 149
4.4.8.1. Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết các
type O, A, C, và asiaư1 và đoạn gene đặc hiệu cho typ O 149
4.4.8.2. Kết quả giải trình trình tự nuclêotide 151
4.4.9. Kết quả phân lập vi rút trên tế bào dòng BHKư21 153
4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM 153
4.4.9.2. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHKư21 153
4.4.9.3. Kết quả gây nhiễm bệnh phẩm nghi có chứa vi rút
LMLM lên tế bào BHKư21 155
4.4.9.4. So sánh chẩn đoán vi rút LMLMbằng RTưPCR từ bệnh phẩm biểu
mô và từ bệnh phẩm biểu mô đã cấy chuyển trên tế bào 156
4.4.10. So sánh phương pháp ELISA và RTưPCR để chẩn đoánưđịnh typ virut LMLM 158
4.4.11. Nhận xét tổng quan về phương pháp RTưPCR trong
chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM 160
Chương IVKết luận và đề nghị 163
Kết luận 163
I. Các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm 163
II. Về nội dung và phương pháp sử dụng 163
III. Về giải pháp khoa học công nghệ 164
IV. Các sản phẩm cụ thể 165
Đề nghị 165
Lời Thank 166
Tài liệu tham khảo 167


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-28-de_tai_nghien_cuu_hoan_thien_cong_nghe_san_xuat_va.F2KaF3b5hX.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52692/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

u giá KT liều 2ml
Hiệu giá KT liều 2,5ml
Một số hình ảnh minh họa của đề tài
Gan của gà bị
nhiễm Salmonella
Ruột tịt của gà bị
nhiễm Salmonella
Salmonella trên
môi tr−ờng MSRV
Salmonella trên
môi tr−ờng XLD
Salmonella trên
môi tr−ờng Kligler
113
4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng vi
khuẩn biến nạp
4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21
Với mục tiêu thu nhận protein tinh sạch do gen fliC3, gm3, sef14 mã hóa kháng
nguyên roi H: i của vi khuẩn S. typhimurium, H:gm, và
kháng nguyên lông sef14 của S. enteritidis để đ−a vào
thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở gà, chúng
tui đã nhân các gen này bằng ph−ơng pháp PCR, sử dụng
các cặp mồi đặc hiệu cho từng gen. Sau đó các gen này
đ−ợc đ−a vào vectơ tách dòng pCR2.1 Các dòng gen đã
đ−ợc đ−a vào vectơ này đ−ợc kiểm tra bằng các enzym
hạn chế và đ−ợc nhân lên thành l−ợng lớn trong tế bào E.
coli DH5α. Sau đó bằng enzym hạn chế NcoI và XhoI đã
đ−ợc thiết kế ở tận cùng đầu ngoài gen, các gen đ−ợc cắt
và đ−a vào vectơ biểu hiện pET22b(+) và đ−ợc biến nạp
vào tế bào E. coli BL21 để biểu hiện gen. Quá trình sinh
tổng hợp các kháng nguyên tái tổ hợp này đ−ợc kiểm soát
Hình 3.1: Phân tích ADN
genom trên gel agarose 0,8%
1: ADN hệ gen của S.
enteritidis ATCC13076
2: ADN hệ gen của S. typhi
murium
3: Thang ADN chuẩn (1Kb)
chặt chẽ bằng sự có mặt của chất cảm ứng IPTG có trong môi tr−ờng. Kết quả đ−ợc
trình bày chi tiết ở phần sau.
4.3.1.1. Đ−a gen vào vectơ pCR2.1
4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn
Salmonella là tế bào vi khuẩn Gram âm. Chúng sẽ bị phá vỡ bởi lyzozym và SDS
trong dung dịch TE. Lyzozym phân giải peptidoglycan (murein), phá vỡ cấu trúc thành
tế bào vi khuẩn bằng cách cắt đứt các liên kết β(1-4) giữa các đơn vị cấu tạo nên
peptidoglican là axit N-axetil muramic (M) và N-axetil glucozamin (G) [1]. SDS tạo
sức căng bề mặt mạnh, đồng thời tạo môi tr−ờng nh−ợc tr−ơng, nhờ đó, tế bào ở thể
nguyên sinh (protoplast) dễ dàng bị vỡ tung. Ngoài ra, SDS cùng EDTA có tác dụng bất
114
hoạt enzym phân giải ADN có sẵn trong tế bào vi khuẩn. Với chức năng tạo phức với
các iôn hóa trị hai (Mg2+), EDTA cạnh tranh các iôn này với các enzym, làm mất yếu
tố hoạt hóa của chúng. Toàn bộ protein của tế bào bị phân cắt bởi protein K không đặc
hiệu và đ−ợc tách khỏi ADN hệ gen bằng dung dịch chloroform/isoamylalcohol. Sau
khi li tâm, dung dịch chứa ADN hệ gen nằm ở pha trên đ−ợc thu nhận và làm tủa bằng
cồn tuyệt đối. ADN hệ gen đ−ợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agaroza
0,8%. Kết quả điện di đ−ợc trình bày trong hình 3.1. Với băng điện di đơn nhất, rõ nét
chứng tỏ ADN hệ gen đã đ−ợctách chiết thành công, rất ít bị đứt gãy, có kích th−ớc đủ
lớn, và không lẫn ARN. Tiếp theo, chúng tui sử dụng ADN genom này để nhân gen
fliC3, gm3, sef14 bằng kĩ thuật PCR.
4.3.1.1.2. Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S. typhi murium, S.
enteritidis
Dựa vào trình tự gen fliC, gm3, sef14 của S. typhimurium, S. enteritidis trong
Ngân hàng gen, chúng tui đã thiết kế các cặp mồi để nhân các gen. Các đoạn mồi để
nhân gen trình tự nh− sau:
Mồi nhân gen fliC3 từ S. typhimurium:
fliC 91f: ACCATggATCgTCTgTCTTCCggTCTg
fliC 1485r:TCTCgAgACgCAgTAAAgAgAggAC
Mồi nhân gen gm3 mã hoá cho H:g,m từ S. enteritidis
gm3f: CCCATggATgCACAAgTCATTAATACAAAC
gm3r:TCTCgAgACgCAgTAAAgAgAggACgTT
Mồi nhân gen sef14 từ S. enteritidis:
sef14f:ACCATggATgCTggCTTTgTTggTAACAAA
sef14r:ACTCgAggTTTTgATACTgCTgAACgTA
Gen fliC3, gm3, sef14 đ−ợc nhân lên theo ch−ơng trình PCR nh− đã trình bày
trong phần ph−ơng pháp. Mỗi chu kì của phản ứng PCR luôn bao gồm ba b−ớc cơ bản
là làm biến tính ADN sợi kép thành sợi đơn, gắn mồi vào sợi đơn, và chuỗi bổ sung
đ−ợc kéo dài nhờ enzym Taq polimeraza. Ngoài ra, enzym Taq polimeraza còn có vai
trò gắn thêm nucleotit A vào đầu 3’ của ADN sợi kép tạo sản phẩm hoàn chỉnh của
115
phản ứng này. Việc gắn thêm nucleotit A vào sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho
việc gắn gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 đ−ợc thiết kế có chứa thêm nucleotit T.
Trên điện di đồ trong hình 3.2 ta thấy, sản phẩm PCR chỉ có một băng ADN đơn
nhất, sắc nét, có kích th−ớc đúng nh− kích th−ớc của các gen đã đ−ợc dự đoán: gen
fliC~1,4kb, gen gm3~1,5kb, sef14~0,5kb. Nh− vậy cặp mồi thiết kế để nhân gen là đặc
hiệu và ch−ơng trình chạy phù hợp.
4.3.1.1.3. Đ−a sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1
Sản phẩm PCR đ−ợc điều chỉnh đến nồng độ 20 àg/ml cho các phản ứng ghép
nối tiếp theo. Vectơ pCR2.1-TOPO đã mở vòng sẵn tại vùng đa nối, mang một nucleotit
T ở mỗi đầu dính 5’. Để ghép nối với vectơ, gen fliC3,gm3, sef14 đã đ−ợc gắn thêm
nucleotit A vào đầu 3’ của mỗi mạch đơn trong phản ứng PCR nhờ enzym trùng hợp
chuỗi Taq polymeraza. Các đầu dính bổ sung A,T sẽ bắt cặp với nhau giúp ghép nối
đoạn gen fliC3 vào vectơ tách dòng. Phản ứng đ−ợc xúc tác bởi enzym T4-ligaza ở
16oC.
Sau hai giờ tiến hành phản ứng ghép nối, hỗn hợp phản ứng đ−ợc biến nạp vào tế
bào E. coli DH5α và đ−ợc cấy trải trên môi tr−ờng LB có bổ sung Ampixilin, IPTG,
Hình 3.2: Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 0.8%
Đ−ờng chạy 1, 4, 5: Thang ADN chuẩn (1Kb)
Đ−ờng chạy 2, 3, 6: Sản phẩm PCR nhân gen fliC3, gm3, sef14
sef14
0,5 Kb
1 2 3 4 5 6
gm3
1,5 Kb
fliC3
1,4 Kb
116
Xgal và ủ ở 37oC khoảng 12 giờ. Trên môi tr−ờng này chúng ta dễ dàng chọn lọc đ−ợc
những dòng tế bào mong muốn nhờ màu sắc khuẩn lạc. Những dòng tế bào mang
plasmid có chứa đoạn gen chèn vào sẽ có màu trắng còn khuẩn lạc chỉ chứa plasmid
không có gen ngoại lai sẽ có màu xanh. Vì vậy, chúng tui chọn ngẫu nhiên những
khuẩn lạc màu trắng và một khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) để cấy chuyển vào
dung dịch LB lỏng có bổ sung ampixilin. Tiếp theo, tế bào của các thể biến nạp đó đ−ợc
thu nhận để tách plasmid kiểm tra.
Plasmid tái tổ hợp đ−ợc thu nhận từ các thể biến nạp và đ−ợc kiểm tra bằng
cách chạy điện di trên gel agaroza 0,8%. Kết quả trên hình 3.3 cho thấy plasmid tái tổ
hợp có kích th−ớc lớn hơn so với plasmid gốc, vì chúng có băng điện di nằm cao hơn.
Nh− vậy chứng tỏ vectơ tách dòng đã có gen ngoại lai chèn vào.
Để chắc chắn đoạn gen ngoại lai chèn vào là gen fliC3, gm3, sef14 nh− mong
muốn chúng tui tiến hành cắt kiểm tra bằng các enzym hạn chế.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Hình 3.3: Phân tích các dòng plasmid trên gel agarose 0,8%
Đ−ờng chạy 1-3: Các dòng pCR2.1 mang gen fliC3
Đ−ờng chạy 1-10: Các dòng pCR2.1 mang gen gm3
Đ−ờng chạy 13-17: Các dòng pCR2.1 mang gen sef14
Đ−ờng chạy 4, 11, 12: Dòng pCR2.1
117
* Đối với vectơ pCR2.1 mang dòng gen fliC3, chúng tui tiến hành cắt kiểm tra
bằng các enzym NcoI, EcoRV và NcoI+XhoI. Theo tính toán lí thuyết, nếu đúng đoạn
gen fliC3 đã chèn vào vectơ, kết quả sản phẩm cắt t−ơng ứng với từng phản ứng sẽ nh−
sau:
(1) Với enzym NcoI: chỉ có một điểm cắt nằm ở một đầu mút của gen fliC3 và
một nằm trong vectơ. Nếu gen gắn xuôi chiều vào plasmid (nh− hình 9 minh họa), sản
phẩm cắt hoàn toàn sẽ gồm hai mảnh có kích th−ớc 3 Kb và 2,3 Kb.
(...

---