Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ hai loại bèo tấm lemna aequinoctialis db1 và spirodela polyrhyza db2
MỤC LỤC
Lời cam đoan
Những từ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Mục lục
Trang
MƠ ̉ ĐÂ ̀ U 1
Chương 1. TÔ ̉ NG QUAN TA ̀ I LIÊ ̣ U 3
1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm 3
1.1.1. Phân bố của bèo tấm 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm 3
1.1.3. Cây phân loại bèo tấm 5
1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm 5
1.1.5. Hệ gen của bèo tấm 7
1.1.6. Giá trị dinh dưỡng 8
1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học 9
1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 10
1.2.1. Cấu trúc gen sinh vật 10
1.2.2. Cấu trúc promoter 11
1.2.3. Vai trò biểu hiện gen của promoter 13
1.2.4. Phân loại promoter 13
1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật 15
1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm 17
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19
Chương 2. NGUYÊN LIÊ ̣ U VA ̀ PHưƠNG PHA ́ P NGHIÊN Cư ́ U 21
2.1. Nguyên liệu 21
2.1.1. Nguyên liệu thực vật 21
2.1.2. Hóa chất 21
2.1.3. Thiết bị 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22
2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose 24
2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24
2.2.4. Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26
2.2.5. Xác định trình tự gen 30
2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 30
Chương 3. KÊ ́ T QUA ̉ VA ̀ THA ̉ O LUÂ ̣ N 31
3.1. Tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm 31
3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài S. polyrhiza 33
3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33
3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 33
3.2.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 38
3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 39
3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài L. aequinoctialis 43
3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43
3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR1.244
3.3.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 46
3.3.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 48
KÊ ́ T LUÂ ̣ N VA ̀ ĐÊ ̀ NGHI ̣ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-luan_van_nghien_cuu_phan_lap_cac_yeu_to_dieu_khien.Y98M57rtY7.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52148/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
hiệu ở phụ lục.
2.1.3. Thiết bị thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và phòng
Công nghệ ADN ứng dụng
Tủ lạnh sâu -200C, -700C (Sanyo, Nhật Bản); Lò vi sóng (Samsung, Hàn
Quốc); Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phân tích (Mettler Toledo 10-4g,
Thụy Sĩ); Máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ); Máy ly tâm lạnh cao tốc (Avanti TM 30
Centrifuge Beckman, Mỹ); Máy ly tâm Eppendorf (Eppendorf 5415C, Đức); Máy
PCR (MJ Research, Inc., Mỹ); Máy soi DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ);
Máy điện di (PowerPac 300, BioRad, Mỹ); Box cấy; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật
* Nguyên tắc
Thành tế bào thực vật được phá vỡ bằng các biện pháp cơ học kết hợp với
việc sử dụng các chất tẩy rửa mạnh. DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất nhờ
dung dịch phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : l). DNA được kết tủa trong cồn
tuyệt đối ở -200C và thu tủa nhờ ly tâm.
* Phương pháp tách chiết DNA tổng số:
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PVP theo Stewart
và Vie (1993) [56]. Bèo tấm nghiền trong nitơ lỏng. Khoảng 1 g mẫu thực vật được
chiết trong 5 ml dung dịch đệm có chứa Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M;
EDTA (pH=8) 10 mM; 0,1% β-mercaptoethanol, 2% CTAB, 1% PVP và 5 mM
ascorbic acid, ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ. Mẫu được sử lý bằng phenol-chloroform
và cuối cùng bằng chloroform. Lớp trên cùng tách ra tủa bằng một phần mười thể
tích Na-acetate 3 M và ba thể tích cồn ở -200C trong 2 giờ. Sau đó rửa lại 2 lần bằng
cồn 70%. Cặn thu được làm khô ở điều kiện chân không và hòa vào 300 µl TE. Loại
RNA bằng RNase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng SDS và PVP theo Angelaes và
cộng sự (2005) [10], có sự thay đổi trong thành phần dung dịch đệm chiết như sau:
NaCl 2 M; Tris-HCl (pH= 8) 0,2 M; EDTA (pH=8) 70 µM; β-mercaptoethanol 0,2
M; PVP 100 mg/2ml dung dịch đệm chiết. Sau đó, cho thêm 0,2 ml 20% SDS đối
với 1 g mẫu thực vật và ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PEG theo
Zuccarello và cộng sự (2006) [67]: thành phần dung dịch đệm chiết có chứa Tris-
HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0.1%
β- mercaptoethanol, 2% CTAB và 1% PEG 6000,
* Quy trình
- Nghiền 1 g lá bằng cối chày sứ (cối, chày sứ phải vô trùng và được giữ ở
-70
0
C) trong nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn.
- Hòa tan mẫu trong 3 ml dung dịch đệm chiết có thành phần: 5 M NaCl;
1 M Tris HCl pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0; CTAB 2%, PVP 2%,
β - mercaptoethanol 0,1 M, sau đó ủ ở 65oC trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ
một lần hay sử dụng thành phần dung dịch chứa PEG 6000: Tris - HCl (pH=8)
0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0,1% β - mercaptoethanol; 4% CTAB
và 2% PEG 6000 sau đó ủ ở 65oC trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ một lần.
- Bổ sung 3 ml phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : 1), lắc nhẹ.
- Ly tâm 12.000 v/p trong 4
0C, 15 phút, tạo thành 3 pha, thu lấy pha trên,
chuyển sang ống ly tâm khác.
- Bổ sung 3 ml chloroform - isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ
- Ly tâm 12.000 v/p trong 4
0
C, 15 phút, thu lấy pha trên, chuyển sang ống
epp mới, mỗi ống 300 µl.
- Tủa DNA: Cho vào mỗi ống epp 50 μl CH3COONa 3 M, 1 ml ethanol
100%. Để ở nhiệt độ -200C trong vòng 3 giờ.
- Sau đó ly tâm 12.000 v/p trong 40C, 15 phút. Thu tủa, rửa tủa bằng 700 μl
ethanol 70% 2 lần. Sấy khô bằng máy hút chân không speed vac, hòa mẫu trong
50 μl nước khử ion vô trùng. Sau đó chạy điện di kiểm tra.
- Loại RNA: Bổ sung RNase vào mẫu DNA thu được để đạt đến nồng độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24
cuối cùng là 100 g/ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ.
- Chạy điện di kiểm tra 5 l sản phẩm DNA thu được trên gel agarose 0,8%
2.2.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose [51]
* Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các
nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của
dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di
chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương.
* Hóa chất
Agarose 0,8% (Hòa 0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X);
Đệm TAE 10mM 1X; EtBr 10 µg/ml; Đệm tra mẫu (glycerol 20%; Tris-HCl
0,1 M, pH 8,0; EDTA 0,01 M, pH 8,0; bromophenol blue 0,25%).
* Quy trình
- Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50 - 600C, đổ
dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút,
khi gel đã đông cứng, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X
ngập cách mặt gel ~ 2 mm.
- Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra
mẫu vào các giếng trên bản gel.
- Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100 V, cường độ
dòng điện 60-80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để
ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút).
- Nhuộm DNA bằng ethidium bromide (EtBr): Bản gel được lấy ra khỏi
khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 10 g/ml trong thời gian 20 phút trên
máy lắc nhẹ. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất.
- Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát
thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio-
Rad với tia UV có bước sóng 320 nm
2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm 1985. Kỹ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25
thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA
mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng
DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi
khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ
mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu.
* Quy trình nhân bản bằng enzyme này bao gồm ba bước được lặp lại nhiều
lần, được tiến hành theo Sambrook và Russell (2001) [51]:
- Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt
độ lên 94 - 950C trong thời gian ngắn.
- Tiếp hợp đoạn mồi thông qua hạ nhiệt độ xuống 50-600C. Hai đoạn mới là
các oligonucleotide dài khoảng 15-30 base sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc bổ sung với
đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.
- Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi: Để tránh
hiện tượng tiếp hợp không đặc thù phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 720C.
Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1 đoạn DNA cần nhân sẽ có 2 đoạn
được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực
tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của
hai đoạn mồi.
* Kỹ thuật PCR bao gồm các thành phần sau đây:
- Một đoạn DNA khuôn mẫu.
- Hai đoạn mồi đặc hiệu có chiều dài 15 - 30 nucleotide.
- Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
- DNA polymerase chịu nhiệt.
Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 μl sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel
agarose 0,8%.
* Thành phần của phản ứng PCR đối với mẫu bèo tấm L. ae...
