Biểu hiện β-Galactosidase trong vi khuẩn
Bacillus subtilis

Nguyễn Thị Thúy

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan cơ sở lý luận về vi khuẩn B: Sơ lược về vi khuẩn B. subtilis,
cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase, Vector biểu hiện gen trong vi
khuẩn, cài nhập vector biểu hiện vào B. subtilis. Giới thiệu nguyên liệu, thiết bị và
phương pháp nghiên cứu. Trình bày một số kết quả đạt được và đưa ra một số
khuyến nghị nhằm nâng cao hiệu quả nghiên cứu của đề tài.

Keywords. Di truyền học; Sinh học; Vi khuẩn Bacillus subtilis

Content
MỞ ĐẦU
Hiện nay, phần lớn các hệ vector (cả hệ vector nhân dòng và vector biểu hiện) cho
Escherichia coli đều đã được thương mại hóa [75]. Tuy nhiên, E. coli được xem là sinh vật
có khả năng gây bệnh và tiết độc tố. Chính vì vậy, việc sử dụng E. coli như tế bào vật chủ để
biểu hiện gen còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó, Bacillus subtilis, đại diện tiêu biểu của nhóm
vi sinh vật Gram dương, với vai trò là tế bào vật chủ, đã thể hiện nhiều ưu điểm hơn so với E.
coli. Đó là khả năng không gây bệnh (B. subtilis được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ
FDA coi là “genereally regarded as safe”- GRAS) và khả năng chịu đựng các điều kiện nuôi
cấy, bảo quản khắc nghiệt hơn [18, 25]. Trong nghiên cứu cơ bản, B. subtilis đã được sử dụng

Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là
tế bào mẹ [54]. Tế bào mẹ nuôi dưỡng tiền bào tử. Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm
sắc thể đã nằm bên trong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông
qua một loại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE [60].
1.3. Cấu trúc genome

Toàn bộ bộ gen của B. subtilis đã được giải trình tự vào năm 1997 [39]. Tế bào vi
khuẩn B. subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể tròn. Kích thước tổng
thể của DNA là 4.214.814 cặp bp (4,2 Mbp). Khoảng 87% bộ gen (bao gồm 4.100 gen) mã
hóa cho protein. Trong 4.100 gen thì có 192 gen được cho là không thể thiếu và 79 gen được
cho là cần thiết cho các quá trình sống của B. subtilis. Hầu hết các gen cần thiết tham gia vào
quá trình trao đổi chất.
1.4. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis
Tính an toàn của B. subtilis đối với ngƣời và động vật
Ở châu Âu và ở Mỹ, B. subtilis được chỉ định là đủ điều kiện về an toàn và không hề
có tác dụng phụ (QPS, Qualified Presumption of Safety) hay GRAS (Genrally Regarded As
Safe) [21]. Một số chủng B. subtilis và họ hàng gần của nó là B. licheniformis, B. pumulis, B.
megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng phá vỡ màng động vật
có vú. Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người [21].
Trong một số các trường hợp người ta vẫn phát hiện ra B. subtilis ở những bệnh nhân bị ung
thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhưng tỉ lệ các trường hợp này là rất
hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca phát hiện có B. subtilis) [21]. Bacillus anthracis là một loài của
Bacillus gây bệnh than nguy hiểm cho người [61, 21].
2. Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase
2.1. Cấu trúc operon lac
Operon lac ở E. coli là operon đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu khá chi tiết từ
năm 1961 bởi Jacob và Monod [2]. Operon lac gồm ba gen cấu trúc là lacZ, lacY và lacA
nằm kề nhau được điều khiển chung bởi một promoter [70]. Hoạt động của operon này được
kiểm soát theo hai cơ chế là tích cực và tiêu cực.
Gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase. Enzyme này xúc tác phản ứng thủy


3.3. Vector biểu hiện trong B. subtilis
Hiện nay đã có nhiều loại vector thương mại dành cho E. coli nhưng vector dành cho
biểu hiện gen trong B. subtilis thì mới có một công ty sản xuất (công ty Mobitec). Có hai lí do
làm giảm khả năng sử dụng của B. subilis:
1. Sản xuất các protease ngoại bào mà nhận biết và phân hủy các protein khác nguồn gốc
(heterologous protein)
2. Tính không ổn định của các plasmid.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Tế bào và plasmid
2.1.2. Hóa chất
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử
2.2.4. Các phương pháp hóa sinh
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thiết kế vector pUL1(PrrnO-RBS (spoVG)) dựa trên vector pET28b
Kết quả là chúng tôi đã thu được một băng duy nhất với kích thước khoảng 244 bp, phù hợp
với kích thước dự đoán theo lý thuyết. Kết quả được thể hiện trong hình 3.1
3.2 Nhân dòng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1
Sản phẩm PCR khuếch đại gen lacZ cùng với vector pUL1 được cắt bằng
các enzyme giới hạn BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng cắt được trình bày trong bảng
3.3.

tinh sạch bằng kit QIA quick gel extration. Tiếp đó, chúng tôi tiến hành phản ứng nối lacZ
vào pUL1 với tỉ lệ thích hợp sao cho tổng thể tích là 12 µl.
3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2
Đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ được khuếch đại từ vector
tái tổ hợp pUL1-lacZ bằng cặp mồi đặc hiệu như được trình bày trong phần nguyên liệu và
phương pháp nghiên cứu. Phản ứng PCR với Taq DNA polymerase có hoạt tính đọc sửa được
thực hiện ở nhiều nhiệt độ gắn mồi khác nhau.
3.4 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome của B.
subtilis PY79 và kiểm tra sự cài nhập này
Vector pDG364 có chứa đoạn DNA này sẽ được duỗi thẳng bằng cách sử dụng enzyme giới
hạn. Chúng tôi tiến hành tìm kiếm một enzyme giới hạn phổ biến, có vị trí cắt trên vector
pDG364 nhưng không có vị trí cắt trong khoảng từ gen amyEf đến amyEb (đoạn này được cài
nhập vào genome B. subtilis PY79). PstI có hai vị trí cắt trong vector pDG364 và thỏa mãn
điều kiện tìm kiếm, do đó enzyme này được lựa chọn để duỗi thẳng vector tái tổ hợp pUL2.
3.5. Xác định hoạt độ của enzyme β-galactosidase
Hoạt tính của gen lacZ trong B. subtilis được kiểm tra theo các phương pháp sau:

- Xác định hoạt tính β-galactosidase bằng phương pháp trải trên đĩa có bổ sung X-gal.
- Xác định hoạt độ β-galactosidase bằng phương pháp sử dụng cơ chất ONPG.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Thiết kế thành công vector pUL1 mang đoạn promoter PrrnO và vị trí bám
ribosome của gen spoVG biểu hiện trong B. subtilis PY79 dựa trên pET28b
2. Nhân dòng thành công gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector
pUL1
3. Nhân dòng thành công đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364
4. Cài nhập và biểu hiện thành công gen mã hóa cho β-galactosidase trong tế bào sinh
dưỡng của chủng B. subtilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng.
KIẾN NGHỊ
1. Tiến hành tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của β-galactosidase

và virus, NXB giáo dục Việt Nam, Hà Nội.
9. Nguyễn Thị Hải Yến (2003), Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym -
galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16, luận văn thạc sỹ sinh học,
ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐHQGHN, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
10. Ashlee M. E., Richard L., Roberto K. (2006), “ Bacillus subtilis Genome Diversity”,
Journal of bacteriology, 189(3), pp. 1163–1170.
11. Bacillus Subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions, Bacillus
genetic stock center catalog vol.4 (2005), Mobitec Molecular biotechnology, Germany.
12. Baillie L. (2001), “The development of new vaccines against Bacillus anthracis”, J.
ApplMicrobiol., 91, pp: 609–613.
13. Bandow J. E., Brötz H., Hecker M. (2002), "Bacillus subtilis Tolerance of
Moderate Concentrations of Rifampin Involves the σ
B -
Dependent General and Multiple
Stress Response”, Journal of Bacteriology, 184(2), pp: 459 - 467.

14. Bui Thu Thuy, Hoang Van Tong, Phan Huong Trang, Phan Tuan Nghia, Huynh
Anh Hong, Simon Cutting, Nguyen Thi Van Anh (2011), “Cloning and expression of
streptavidin on the outer coat of Bacillus subtilis PY79 spores”, VNU Journal of Science,
Natural Science and Technology 27, 2S, pp:285.
15. Burbulys D., Trach K. A., Hoch.J. A. (1991), “Initiation of sporulation in B. subtilis is
controlled by a multicomponent phosphorelay”, Cell,64, pp:545-552.
16. Coenen T. M. M., Bertens A. M. C., Hoog S. C. M., Verspeek R. C. M. (2000),
“Safety evaluation of a lactase enzyme preparation derived from Kluyveromyces lactis”,
Food and Chemical Technology, 2000, pp: 671-677.
17. Drabner B., Guzman C.A. (2001), “ Elicitation of predictable immune responses
by using live bacterial vectors”, Biomol Eng., 17(3), pp:75-82.
18. Driks. A. (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiology and Molecular
Biology Reviews , 1, p:63.

Bacillus subtilis: Requirements of its use in expression vectors”, Microbial Cell
Factories, 10 (1), pp: 10- 83.
32. Horwitz J. (1964), “Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some
Substituted 3-Indolyl-b-D-glycopyranosides”, J.Med. Chem., 7, pp:574-575.
33. Iber D., Clarkson J., Yudkin M. D., Campbell I. D. (2006), “The mechanism of cell
differentiation in Bacillus subtilis”, Nature, 441(7091), pp: 371-374.
34. Isticato R., Cangiano G., Tran H. T., Ciabattini A., Medaglini D., Oggioni M. R., De
Felice M., Pozzi G., Ricca E. (2001), “Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis
spores”, J. Bacteriol., 183(21), pp: 6294-301.
35. Kees J. L., Kok J., Gerard V. (1989), “Campbell-Like Integration of
Heterologous Plasmid DNA into the Chromosome of Lactococcus lactis subsp. lactis”,
Applied and environmental Microbiology, 55, pp: 394-400.
36. Keggins K. M., Lovett P. S., Duvall.E. J. (1978), “Molecular cloning of
genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the
vector plasmid pUB110”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pp:1423-1427.
37. Kobayashi K., et al. (2003) "Essential Bacillus subtilis genes". Proc. Natl. Acad.
Sci. U S A, 100(8), pp: 4678-4683.

38. Krásný L. and Gourse L. Richard. (2004), “An alternative strategy for bacteria
ribosome synthesis: B rRNA transcription regulation”, BMBO Journal, 23, pp: 4473-
4483.
39. Kunst F., et al. (1997), "The complete genome sequence of the Gram-positive
bacterium Bacillus subtilis". Nature., 390, pp: 249-256.
40. Lee S., Belitsky B. R., Brinker J. P., Kerstein K. O., Brown D.W., Clements J.D.,
Keusch G. T., Tzipori S., Sonenshein A. L., Herrmann J. E. (2010), “Development of a
Bacillus subtilis-based rotavirus vaccine”, Clinical and Vaccine Immunology, 17 (11), pp:
1647-1655.
41. Lepesant-Kejzlaro J., Lepesant J A., Walle J., BillaultA. (1975), “ Revision of
the linkage map of Bacillus subtilis 168: Indications for circularity of the chromosome”,
J. Bacteriol., 121, pp: 823-834.

bacterial beta-galactosidase, thesis of Suranaree University of Technology, page: 70,
Thailand.
54. Perez A.R., Abanes-De Mello A., Pogliano K. (2000), "SpoIIB Localizes to Active Sites of Septal
Biogenesis and Spatially Regulates Septal Thinning during Engulfment in Bacillus subtilis", Journal of
Bacteriology, 182(4), pp: 1096-1108.
55. Phan T. T. P., Nguyen H. D., Schumann W. (2005), “Novel plasmid-based
expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in
Bacillus subtilis”, Protein Expr. Purif., 46(2), pp: 189-95
56. Rooney A. P., Neil P. J. P., Ehrhardt C., James L. S., Jason D. B. (2009),
“Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and
description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum subsp. nov.”, Appl. Environ.
Microbiol, 59(10), pp: 2429-2436.
57. Samarrai.W., David X. L., Ann-Marie W., Barbara S., Jacob E., Anita S., Russell L. W., Rivka
R. (2010), “Differential Responses of Bacillus subtilis rRNA Promoters to Nutritional Stress”,Journal of
Bacteriology, 193(3), pp: 723-733.
58. Sambrook J., Fritsch E.F. and T. Maniatis (1989), “Molecular Cloning A Laboratory Manual”.
Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press pp:1-74.
59. Sangun L., Boris R. B., James P. B., Kathryn O. K., David W. B., John D. C. , Gerald T. K.,
Saul T., Abraham L. S., John E. H. (2010), “Development of a Bacillus subtilis-Based Rotavirus
Vaccine”, Clin. Vaccine Immunol.,17 ( 11), pp: 1647-1655.

60. Schaechter M., Ingraham J. L., Neidhardt F. C. (2006). Microbe., American
Society for Microbiology, Washington, D.C, U.S.A.
61. Schlessinger D. (1976), Microbiology, American Society for Microbiology,
Washington, D.C, USA.
62. Spizizen J. (1958), “ Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by
deoxyribonucleate”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,44, pp:1072-1078.
63. Stanghellini M. E., Rasmussen S.L. (1989), “Two new diseases of Salicornia sp. caused by
Bacillus subtilis and Macrophomina phaseolina”, Annual Meeting of the American
Phytopathological Society, Pacific Division, 79(8), p: 912.