Mức độ nhiễm vi nấm sinh ochratoxin A trong
đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trồng cà
phê trọng điểm Lý Thu Hương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: PGS.TS. Kiều Hữu Ảnh
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Khảo sát sự nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum
sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê. Phân lập và phân loại chủng nấm mốc
A.niger và P.viridicatum trong đất và rễ cây cà phê. Xác định khả năng sinh
ochratoxin A của các chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum nhiễm trong đất và rễ
cây cà phê.

Keywords. Vi sinh vật học; Vi nấm; Cây cà phê; Đất; Nấm mốc Content
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cà phê là một trong những sản phẩm nông nghiệp chính có giá trị kinh tế cao của
nước ta. Cà phê là nông sản được xuất khẩu với số lượng lớn sang các nước thuộc khối
ASEAN, Nhật Bản, Cộng hoà liên bang Nga và một số nước Đông Âu. Vì vậy, việc nâng cao
chất lượng cà phê nói riêng và các nông sản nói chung bao gồm các kỹ thuật bảo hiểm trên
nông sản đồng thời chế biến chúng thành những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng bảo quản giữ

- Phân lập và phân loại chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum trong đất và rễ cây
cà phê.
- Xác định khả năng sinh ochratoxin A của các chủng nấm mốc A.niger và
P.viridicatum nhiễm trong đất và rễ cây cà phê. Chƣơng 1: TỔNG QUAN

1.1. Hệ nấm mốc trên lƣơng thực
1.1.1. Hệ nấm mốc ngoài đồng
Các hạt lương thực hay hạt giống trước khi thu hoạch có thể bị nấm mốc xâm nhiễm.
Các nấm mốc ngoài đồng được phân biệt theo các loại ngũ cốc, vùng, địa lý cư trú, thời
tiết,… Một số loại nấm mốc ngoài đồng điển hình là Alternaria, Cladosporium,
Helminthosporium, và Fusarium. Tất cả các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua được trong
nhiều năm ở hạt khô.
Các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng tới bề ngoài và chất lượng của hạt. Thông
thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước khi thu hoạch có thể phát hiện
ra bằng phương pháp giám định thông thường và không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo
quản. Điều này được nhận biết rõ nhất là bắp, khi chín khô ngoài đồng, chưa thu hoạch kịp,
gặp mưa có độ ẩm cao, các loại nấm mốc có nguồn gốc từ đất tấn công vào nông sản. Muốn
khắc phục tình trạng này cần phải thu hoạch kịp thời, không nên để lâu ngoài đồng. Sau khi
thu hoạch phải phơi sấy ngay cho khô đến khi độ ẩm còn 13% mới đem bảo quản.
1.1.2. Hệ nấm mốc bảo quản
Các nấm mốc bảo quản thường thấy ở trên các nguyên liệu có nguồn gốc hữu cơ và
vô cơ đa dạng, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng nhiễm trên
các hạt lương thực và hạt giống sau khi thu hoạch. Nguyên nhân chủ yếu là do độ ẩm trong
thức ăn còn cao (> 14%) đã đem dự trữ hoặc do độ ẩm không khí trong kho cao hấp thu trở
lại vào nguyên liệu, do chênh lệch nhiệt độ ngày đêm làm cho nước ngưng tụ trên bề mặt lớp
thức ăn gây ra hiện tượng ẩm cục bộ, tạo điều kiện tốt cho nấm phát triển. Theo nghiên cứu
của Christensen [9] hệ nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, (trong đó chỉ năm

1
, G
2
, M
1
, M
2
), ochratoxin A,
stermatocystin, axit cyclopianxoic.
Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và axit
cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.
Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin.
Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion.
Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà [45]
Độc tố nấm mốc ngày càng thu hút sự quan tâm, nghiên cứu của các nhà khoa học ở
nhiều lĩnh vực khác nhau. Rất nhiều hội nghị quốc tế, hội thảo, chuyên khảo, tạp chí và các
bài báo nghiên cứu về vấn đề có tính cấp thiết này.
Những giải pháp phòng trừ Mycotoxin:
- Nên chọn nguyên liệu mới làm thức ăn chăn nuôi.
- Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước, trong khi dự trữ và lúc sử dụng để trộn
thức ăn cho thú.
- Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu.
- Bảo quản nguyên liệu nơi khô ráo.
- Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho: côn trùng hô hấp đốt chất
dinh dưỡng sinh ra H
2
O làm ẩm nguyên liệu giúp nấm mốc phát triển đồng thời khi di chuyển
chúng đã mang theo bào tử nấm phát tán nhanh trong kho.
- Sử dụng hóa chất chống nấm mốc: có nhiều chất hóa học khác nhau có thể khống
chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn, hiện nay có thể nói chất tương đối an toàn không độc


Bảng 1.1: Tính chất hoá lý của các ochratoxin
Ochratoxin
Công thức
phân tử
Trọng lƣợng phân
tử (MW)
Điểm nóng chảy
(ºC )
Ochratoxin A
C
20
H
18
O
6
NCl
417
105-110
Ochratoxin B
C
20
H
19
O
6
N
369,15
221
Ochratoxin C

ochratoxin A sẽ tạo ra phenylalanine và axit lacton hoạt động về mặt quang học. Ochratoxin
C là chất trao đổi tìm thấy ở nước tiểu của động vật ăn thức ăn có nhiễm ochratoxin A. [6]
1.3.3. Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc
Ochratoxin A đầu tiên được phân lập từ Aspergillus ochraceus nhưng những nghiên
cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và Penicillium cũng tạo ochratoxin
A.
Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Aspergillus gồm: A.ochraceus, A. elegans,
A.fresenii, A.melleus, A.ostianus, A.petrakii, A.screrotium, A.sulphureus.
Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Penicillium gồm: P.verrucosum, P.viridicatum,
P.chrysogenum, P.commune và P.cyclopium, P.expansum, P.palitans, P.purpurescence,
P.nordiceum, P.variable.[4]
Ochratoxin A được tạo ở nhiệt độ tối thích từ 20º- 30ºC và hoạt độ nước 0,953 (39%
hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt độ cao hơn hàm ẩm yêu cầu
cao hơn a
w
= 0,997 hay 52% ẩm. Các nấm Penicillium thường tạo ochratoxin A trong điều
kiện nhiệt độ thấp còn các nấm Aspergillus thường tạo ochratoxin A ở nhiệt độ cao hơn. [1]
1.3.4. Độc tính của ochratoxin A
Tác dụng độc đầu tiên của ochratoxin A là ức chế sinh tổng hợp protein. Tác dụng là
đặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp phenylalanin tRNA
Phe
. Thận là cơ
quan nhạy cảm nhất đối với ochratoxin A. Ochratoxin A có thể gây ra tổn thương cấp tính
cũng như mãn tính cho thận. Ochratoxin A tác động lên hệ miễn dịch, làm suy giảm hệ thống
miễn dịch và có khả năng gây quái thai. Ochratoxin A còn là một trong những chất gây ung
thư. Những kết quả nghiên cứu cho thấy, việc cho uống ochratoxin A trong thời gian 2 năm ở
các liều từ 3500 đến 6000 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày ở chuột cái và 70 ng/kg trọng lượng
cơ thể/ngày ở chuột đực đã kích thích tạo các u, trước hết là các u thận. Bệnh thận địa
phương của vùng Balkan (BEN), chẳng hạn như vùng Vratza của Bulgari là một bệnh nghiêm
trọng. Bằng chứng đã rõ là với cách bảo quản truyền thống đã khiến lương thực thực phẩm ở

50
(mg/kg trọng lƣợng cơ thể)
Trong miệng
Trong màng bụng
Trong tĩnh mạch
Chuột mới sinh
3,9 Chuột
46 - 58
22 - 40
26 - 34
Chó
0,2 Lợn
1 Gà
3,3
1.3.5. Phƣơng pháp phân tích
Phương pháp phân tích ochratoxin A gồm các bước: chiết xuất, làm sạch chất chiết,
định tính và định lượng.
Chiết xuất: Sử dụng hệ dung môi phù hợp để chiết được chọn lọc ochratoxin A cần

thành đồ thị ở các đỉnh sắc ký.
Sắc ký lỏng cao áp là hệ thống thiết bị hoàn thiện với độ xác định chính xác cao
đối với việc phân tích các mycotoxin. Giới hạn phát hiện đối với ochratoxin A là 0.5 ng/kg.
Trước sự nguy hiểm của ochratoxin A, tổ chức nông lương thế giới (FAO) và tổ chức
y tế thế giới (WHO) đã có những chương trình khuyến cáo về phòng chống ochratoxin A trên
lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc và đưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin
A. Các quốc gia trên thế giới cũng đã đưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A
trên lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc cho quốc gia của mình.
Theo FAO và WHO thì giới hạn ochratoxin A trong nông sản thực phẩm là 10 ng/ kg
trọng lượng cơ thể/tuần. Năm 2004, cộng đồng châu Âu đã đưa ra tiêu chuẩn giới hạn
ochratoxin A là 5ppb trong đất, rễ cà phê và 10ppb trong cà phê chế biến. Tại Việt Nam giới
hạn ochratoxin A trong nông sản là 35 ng/ kg [48].
Mức độ nhiễm ochratoxin A đã trở thành một trong những chỉ tiêu xuất khẩu nông sản
của các hợp đồng thương mại quốc tế.
1.3.7. Tình hình nghiên cứu phòng chống ochratoxin A trên thế giới và Việt Nam
Bên cạnh việc kiểm tra, giám sát mức nhiễm ochratoxin A, việc phòng chống
ochratoxin A trên nông sản đã được nhiều quốc gia trên thế giới nghiên cứu. Một số biện
pháp được Bộ Nông nghiệp Mỹ và cộng đồng châu Âu khuyến cáo nhằm phòng chống các
mycotoxin nói chung và ochratoxin A nói riêng đó là:
- Phát triển các cây trồng có khả năng đề kháng nấm
- Kiểm soát sự nhiễm các loài nấm sinh độc tố trên cây trồng ở ngoài đồng
- Xác định đúng thời gian trước thu hoạch, thu hoạch và sau thu hoạch cho cây trồng
- Giảm hàm ẩm của các hạt lương thực sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản
- Bảo quản các nông sản ở nhiệt độ thấp nếu có thể
- Sử dụng các chất diệt nấm và các chất bảo quản để ngăn chặn sự phát triển của nấm
mốc
- Kiểm soát sự xâm nhiễm của các côn trùng trong bảo quản bằng việc sử dụng các chất
diệt côn trùng,…
Các nghiên cứu về nguyên nhân nhiễm nấm mốc trong quá trình bảo quản nông sản
của nhà khoa học Mỹ Christensen [9] cho thấy, đất là nơi phát sinh đầu tiên của các nấm

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tƣợng
Các mẫu đất và rễ cây cà phê được lấy ở các xã khác nhau của tỉnh ĐắkLắk và
ĐắkNông bao gồm: 50 mẫu đất và 30 mẫu rễ cây cà phê.
Các mẫu ngô dùng làm cơ chất để kiểm tra khả năng sinh Ochratoxin A của các chủng
đã phân lập được lấy ở các cửa hàng bán lẻ thuộc các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Tây.
2.1.2. Môi trƣờng
Môi trường thạch khoai tây (PDA)
Môi trường Czapek – Dox (g/l) :
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố ochratoxin A
Tiến hành theo phương pháp của FAO
Phương pháp lấy mẫu đất và rễ cây cà phê:
Mỗi mẫu lấy khoảng 25g đất và rễ cây cà phê sau đó cho vào túi nilon buộc kín. Phải
ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu trên mỗi mẫu đất và rễ cà phê. Mẫu được bảo quản trong tủ
lạnh trước khi đem phân tích
Phương pháp lấy mẫu ngô:
Với mỗi mẫu ngô thu nhập ngoài chợ, cửa hàng thì khối hạt ngô được trộn đều lấy
1kg làm đại diện. Một đại diện được trộn đều rồi chia tư, một phần từ đó lại được trộn đều và
chia tư lấy 10g làm mẫu phân tích.
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc từ đất và rễ cây cà phê
Tiến hành theo phương pháp của phòng Vi sinh, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công
nghệ Sau thu hoạch.
2.2.2.1. Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất trồng cà phê
Mẫu đất trồng cà phê được nghiền nhỏ, cân lấy 1g và cho vào ống nghiệm đã có sẵn
9ml nước cất đã thanh trùng ở 121ºC trong 60 phút. Đánh tan và lắc đều bằng máy vovtex.
Hút 1 ml dịch trên cho vào ống nghiệm có sẵn 9 ml nước cất đã thanh trùng. Tiến hành pha
loãng đến nồng độ thích hợp. Hút 1000ml dịch chứa mẫu đã pha loãng vào hộp Petri đã được
sấy khử trùng ở 160ºC trong 2h. Sau đó đổ môi trường PDA lỏng (có bổ sung axit lactic 0.4%

nguội đến gần 45
0
C rồi phân vào các hộp này, sau đó quay vòng hộp petri để trộn đều các bào
tử được pha loãng. Để vào tủ ấm 30
0
C, việc phân lập được tiến hành từ những hộp có số
lượng khuẩn lạc giới hạn từ 30 đến 100 những khuẩn lạc riêng biệt đồng đều. [6]
Để phân loại đến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất, chúng tôi sử dụng
tài liệu của Raper và Fennell (The genus Aspergillus). [36]
Để phân lập đến loài của chi Penicillium, chúng tôi sử dụng tài liệu của Thom
Fennell (The penicillium). [34]
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích ochratoxin A
Chúng tôi tiến hành phân tích ochratoxin A theo phương pháp của Shimomura và
Ishikuro [40]. Phương pháp này gồm các giai đoạn:
2.2.5.1. Chiết xuất
Các mẫu ngô được xay nhỏ. 10g ngô đã xay được bổ sung 5ml axit axetic 5% và 50ml
cloroform. Mẫu được nghiền bằng máy nghiền đồng thể Polytron trong 5 phút. Lắc dịch
nghiền trên trong 30 phút và lọc qua Na
2
SO
4
khan. 25ml dịch lọc được lấy để làm khô ở máy
cô chân không quay. Cho 2ml toluen vào chất chiết, sau đó bảo quản ở 4ºC cho đến khi làm
sạch.
2.2.5.2. Làm sạch
10ml toluen được cho vào vi cột Sep-pak silica cartridge để rửa cột. 2ml dung dịch
mẫu được đưa vào vi cột. Sau đó cột được rửa với 10ml toluen và 6ml clorofom-metanol (97:
3). Ochratoxin A được chiết rút với 10ml toluen- axit axetic (9: 1). Làm khô bằng máy cô
chân không quay.
Tiến hành định tính và định lượng ochratoxin A theo phương pháp sắc ký bản mỏngvà

C
X


21
1,0

Trong đó:
C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên mỗi hộp Petri giữ lại ở nồng độ có
khuẩn lạc từ 30-100.
n
1
: số đĩa giữ lại ứng với độ pha loãng đầu.
n
2
: số đĩa giữ lại ứng với độ pha loãng thứ 2.
d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu.
Lấy 1ml hỗn dịch Aspergillus niger và 1ml hỗn dịch Penicillium nhiễm vào môi
trường ngô không có ochratoxin A đã khử trùng, nuôi cấy các chủng Aspergillus niger ở 28-
30
0
C, Penicillium ở 25ºC trong 9 ngày, mỗi ngày lấy ra lắc đều.
Tiến hành chiết xuất ochratoxin A từ các mẫu ngô đã nhiễm các chủng Aspegillus niger và
Penicillium (theo phương pháp 2.2.5). Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ

1. Các mẫu đất và rễ cây cà phê ở Đắclắk, Đắc Nông đã nhiễm các nấm mốc
Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A. Mức độ nhiễm

4. Đặng Hồng Miên(1980), Nấm mốc độc trong thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà
Nội, tr 187- 190.
5. Lương Đức Phẩm và Vũ Kim Dũng (1980), “ Vi sinh vật trong lương thực, thực phẩm ”, Tạp chí
Lương thực- thực phẩm.
6. Nguyễn Phùng Tiến (1983), Nấm mốc trên một số sản phẩm thực phẩm. Luận án phó tiến sĩ y học,
Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội.

Tài liệu Tiếng Anh
7. Abouzied MM, Horvath AD, Podlesny PM, (2002). "Ochratoxin A concentrations in food and feed
from a region with Balkan Endemic Nephropathy". Food additives and contaminants 19 (8): 755–64.
8. Al-Anati L, Petzinger E (2006). "Immunotoxic activity of ochratoxin A". J. Vet. Pharmacol. Ther.
29 (2): 79–90.
9. Aleckovic M (2010). "Glomerular filtration rate in examined population of Bosnian Posavina –
region of Balkan Endemic Nephropathy". Bosn J Basic Med Sci 10 (3–4): 256–61.
10. AOAC (1990). Official methods of Analysi, Association of official analytical Chemists,
Washington.
11. Basic-Jukic N. (2007). "Renal transplantation in patients with Balkan endemic nephropathy".
Transplant Proc 39 (5): 1432–1435.
12. Battacone G. Nudda A. Pulina G. (2010). "Effects of Ochratoxin A on Livestock Production".
Toxins 2: 1796–1824.
13. Belmadani A. (1999). "Selective toxicity of ochratoxin A in primary cultures from different brain
regions". Arch Toxicol 73 (2): 108–114.
14. Bendele AM, (1985) "Ochratoxin A Carcinogenesis in the (C57BL/6J X C3H)F1mouse". J. Natl
Cancer Inst ;75(4):733-42.
15. Blesa J, (2006). "Factors affecting the presence of ochratoxin A in wines". Critical reviews in
food science and nutrition 46 (6): 473–8.
16. Boonen, Jente; Malysheva, Svetlana V.; Taevernier, Lien; Diana Di Mavungu, José; De Saeger,
Sarah; De Spiegeleer, Bart (2012). "Human skin penetration of selected model mycotoxins".
Toxicology 301 (1–3): 21–32
17. Castegnaro M (2006). "Balkan endemic nephropathy: role of ochratoxins A through

31. Palma N, (2007). "Ochratoxin A-Induced Mutagenesis in Mammalian Cells Is Consistent with
the Production of Oxidative Stress". Chemical Research in Toxicology 20 (7): 1031–1037.
32. Pestka, Steinert, Chu F.S (1981), Enzyme- Linked Immunosorbent Assay for detection of
ochratoxin A, App Envir Microbiol, pp 1472- 1474.
33. Pfohl-Leszkowicz A, Manderville RA (2007). "Ochratoxin A: An overview on toxicity and
carcinogenicity in animals and humans". Mol Nutr Food Res 51 (1): 61–99.
34. Pitt, J.I, Hocking (1985), Methods for Isolation Enumeration and identification Fungi and
Food spoilage, Academic press, London, pp 29 - 34.
35. Polizzi V.,(2009) "Fungi, mycotoxins and volatile organic compounds in mouldy interiors from
water-damaged buildings". Journal of Environmental Monitoring 11 : 1849–1858; 2009
36. Rapper, K. Fennel (1965), The genus Aspergillus, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland.
37. Rashidkhani B. (2005). "Major dietary patterns and risk of Renal Cell Carcinoma in a
prospective cohort of Swedish women". J.Nutr. 135: 1757–1762.
38. Richard JL, (1999.). "The occurrence of ochratoxin A in dust collected from a problem
household". Mycopathologia 146 (2): 99–103.
39. Sava V., (2006.). "Acute neurotoxic effects of the fungal metabolite ochratoxin A".
Neurotoxicology 27 (1): 82–92.
40. Shimomura M, Shiguo E (1989), Quantitative method of ochratoxin A in cereals and mixed
feeds by high- performance liquid chromatography, Shinyo-Kenkyu- Hokoku, pp 1- 9.
41. Shotwel, Hesseltine, C.W & Goulden (1969), Ochratoxin A- Occurrence as natural contaminant
of a corn sample, Appl, Microbal, pp 765- 766.

42. Shotwell, Hesseltine, C.W & Goulden, Vandergraft (1970), Survey of corn for aflatoxin,
zearalenone and ochratoxin, Cereal Chem 47.
43. Sobolev, V.S (1984), Chemical analytic methods of Trichothecenes, FAO/UNEF/USSR
International Training Course “ Training activities on food contamination control and monitoring
with special reference to mycotoxin ”, Moscow.
44. Speijers G. A, Egmond H. P (1993), Worldwide ochratoxin A levels in foods and feeds. Colloque
INSERM/John Libbey Eurotext Ltd pp 85- 100.
45. Steyn S.P (1993), Mycotoxin of human health concern, Colloque Inserm/John Libbey Eurotext