1
Nghiên cứu sử dụng nấm LECANICILLIUM
Kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau

Vũ Xuân Đạt
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học
Chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60.42.40
NNgƣời hƣớng dẫn: PGS TS Quyền Đình Thi
Năm bảo vệ: 2011

Abstract. Tổng quan về rệp hại cây trồng; thuốc diệt côn trùng hóa học; thuốc diệt
côn trùng nguồn gốc sinh học; sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng. Nghiên cứu ảnh
hƣởng của môi trƣờng lên sự sinh bảo tử của nấm Lecanicillium: nguồn carbon; nguồn
nitơ; nhiệt độ môi trƣờng; độ ẩm không khí và độ ẩm cơ chất. Trình bày vật liệu, hóa
chất và thiết bị: chủng giống và plasmid, hóa chất, dung dịch và đệm, môi trƣờng nuôi
cấy. Trình bày phƣơng pháp nghiên cứu: sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao;
các phƣơng pháp sinh học phân tử; xác định ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng lên
sự sinh bào tử của chủng nấm 485. Đƣa ra kết quả và thảo luận: sàng lọc chủng nấm
có độc lực cao; định tên chủng nấm 485; ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng lên sự
sinh bào tử của L. lecanii 485.

Keywords: Vi sinh vật học; Rệp; Ký sinh trùng; Nấm Content
Rệp (Aphidoidae) là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế giới, kí
sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ khác nhau, trong đó có nhiều cây trồng quan trọng
nhƣ bông, cải, cải dầu, các loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc. Hàng năm, rệp cùng với các
côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lƣợng cây trồng trên toàn thế giới. Do tính chất nguy hại
của rệp, việc sử dụng các biện pháp phòng trừ rệp là cần thiết.

soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết. Biện pháp kiểm soát rệp và các loại côn trùng khác
đƣợc áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp.
Thuốc diệt côn trùng hóa học
Thuốc diệt côn trùng (thuốc trừ sâu) chiếm tỉ lệ lớn trong thuốc bảo vệ thực vật.
Chúng có nguồn gốc tự nhiên hoặc đƣợc tổng hợp hoàn toàn trong các nhà máy hóa chất,
đƣợc sử dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng, hoặc phi nông nghiệp để tiêu diệt các
vectơ truyền bệnh cho ngƣời và vật nuôi nhƣ ruồi, muỗi.
Ƣu điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học là dễ sản xuất ở quy mô lớn với giá thành
rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh. Tuy nhiên, chúng ngày
càng bộc lộ rõ những nhƣợc điểm nhƣ nhanh bị kháng bởi côn trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn
nƣớc và không khí, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời.
Vì những nhƣợc điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học, xu hƣớng chung trên thế giới
hiện nay là không sử dụng thuốc diệt côn trùng hoặc sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để
thay thế dần nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững.
Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học
Mặc dù có một số nhƣợc điểm nhƣ giá thành sản xuất còn cao, hoạt lực không mạnh
bằng hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, hiệu quả bị ảnh hƣởng nhiều bởi các điều
kiện ngoại cảnh, nhƣng với các ƣu điểm vƣợt trội so với hóa chất tổng hợp về độ thân thiện
với môi trƣờng, hệ sinh thái và sức khỏe con ngƣời, các chế phẩm sinh học ngày càng đƣợc
nhận đƣợc nhiều sự quan tâm trong nghiên cứu và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp.
Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp
Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae.
Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng nhƣ rệp,
ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bƣớm. Cơ chế diệt côn trùng của
Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám trên vỏ côn
trùng (chitin), các bào tử nảy mầm rồi tiết enzyme (chitinase, proteinase) phân hủy lớp biểu
bì, kết hợp với áp lực nảy mầm của bào tử nấm giúp sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong
cơ thể. Tại đây, sợi nấm tiết các enzyme (proteinase, lipase, chitinase) thủy phân các mô, tiết
các độc tố nấm gây độc thần kinh cho côn trùng. Kết quả là côn trùng bị tổn thƣơng, bị đa
nhiễm bởi Lecanicillium và các vi sinh vật gây bệnh khác. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp

Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 do Phòng
Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH và CN Việt Nam cung cấp.
Rệp hại rau lấy trên rau cải ngoài đồng ruộng sau đó đƣợc nuôi trên cải thảo trong
phòng thí nghiệm.
Các hóa chất đƣợc sử dụng có độ tinh khiết cao, đƣợc cung cấp bởi các hãng có uy tín
nhƣ Invitrogen, Fermentas…
Các thiết bị đƣợc sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, đƣợc cung cấp
bởi các hãng có uy ín về thiết bị sinh học nhƣ Eppendorf, Pharmacia…
Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp sàng lọc đƣợc sử dụng để lựa chọn chủng nấm có độc lực diệt rệp cải
cao.
Phƣơng pháp sinh học phân tử, xác định và so sánh trình tự gen 28S rRNA để xác định
tên nấm.
Phƣơng pháp tối ƣu đƣợc sử dụng để lựa chọn môi trƣờng phù hợp để lên men nấm
thu bào tử cao nhất.

4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao
Sau 7 ngày phun, chủng 485 có khả năng diệt rệp cải cao nhất với 67 ± 7% rệp bị diệt.
Chủng L18 hầu nhƣ không diệt đƣợc rệp, là chủng có độc lực yếu nhất.
0
10
20
30
40
50
60
70

HM057107 Verticillium sp.
AY312604 Verticillium sp.
EF026003 Lecanicillium lecanii
EF026005 Lecanicillium lecanii
Lecanicillium sp. 485
80 70 60 50 40 30 20 10 0
82,7
L1185

5
0
1
2
3
4
5
6
G BG CG BN LG LN MG MN
Các nguồn cơ chất
Số lượng bào tử (x10
9
/g cơ chất)

Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485
G: gạo, BG: bột gạo, CG: cám gạo, BN: bột ngô, LG: bột lõi ngô/bột gạo,
LN: bột lõi ngô/bột ngô, MG: bột bã mía/bột gạo, MN: bột bã mía/bột ngô.
Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất
Môi trƣờng gồm bột lõi ngô/bột ngô sau khi đƣợc lựa chọn, ảnh hƣởng của tỉ lệ hai
thành phần này lên sự sinh bào tử của chủng nấm L. lecanii 485 đã đƣợc khảo sát. Tỉ lệ bột lõi
ngô/bột ngô bằng 1:1 (w/w) cho sự sinh bào tử cao nhất với (5,37 ± 0,95)×10

9
12
8 12 16 20 24 28 32
Độ dày cơ chất (mm)
Số lượng bào tử (x10
9
/g cơ chất)

Ảnh hƣởng của độ dày cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất
Khi lƣợng nƣớc đƣợc bổ sung bằng 70% cơ chất (tƣơng đƣơng với độ ẩm môi trƣờng
cơ chất 41%), chủng L. lecanii 485 sinh bào tử cao nhất, đạt đƣợc (5,43 ± 1,08)×10
9
bào tử/g
cơ chất.
1
2
3
4
5
6
7
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Lượng nước bổ sung so với cơ chất khô (%)
Số lượng bào tử (x10
9
/g cơ chất)

Ảnh hƣởng của độ ẩm cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

4
)
2
SO
4
, số lƣợng bào
tử đạt đƣợc (1,159 ± 0,050)×10
10
Ảnh hƣởng của một số nguồn nitơ vô cơ lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485
KBS: không bổ sung nguồn nitơ vô cơ

Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4

Sau khi đƣợc xác định là nguồn nitơ vô cơ phù hợp, ảnh hƣởng của (NH
4
)
2
SO
4
ở các
nồng độ khác nhau lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 đã đƣợc khảo sát. Kết quả
nồng độ (NH

3
(NH
4
)
2
SO
4
(NH
4
)
2
HPO
48
0
2
4
6
8
10
12
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60
Nồng độ (NH
4
)
2
SO
4

14
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Nồng độ MgSO
4
(%)
Số lượng bào tử (x10
9
/g cơ chất)

Ảnh hƣởng của nồng độ MgSO
4
lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485
Ảnh hưởng của nồng độ KH
2
PO
4

Sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 cao nhất khi bổ sung KH
2
PO
4
ở nồng độ 0,1%
và 0,25%, với số lƣợng bào tử đạt đƣợc lần lƣợt là (1,156 ± 0,043)×10
10
và (1,159 ±
0,008)×10
10
bào tử/g cơ chất. Tuy nhiên, với các nồng độ KH
2
PO


Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng
Trong ba chế độ chiếu sáng đã đƣợc khảo sát, chủng L. lecanii 485 sinh bào tử cao
nhất ở chế độ chiếu đáng thông thƣờng (12 giờ/ngày) với số lƣợng bào tử đạt đƣợc lần lƣợt là
(1,326 ± 0,050)×10
10
.
8
10
12
14
0 12 24
Thời gian chiếu sáng (giờ/ngày)
Số lượng bào tử (x10
9
/g cơ chất)

Ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của thời gian lên men
Sau 8 ngày lên men, số lƣợng bào tử của nấm L. lecanii 485 đạt đƣợc tối đa với (1,353
± 0,019)×10
10
bào tử/g cơ chất.

10
9
10
11
12

bào tử/g cơ chất.
KẾT LUẬN
1. Chủng 485 có độc lực cao nhất đối với rệp cải trong số 7 chủng nấm đƣợc nghiên
cứu. Trong điều kiện 21-25°C và độ ẩm không khí 75-80%, dung dịch bào tử của chủng 485
có mật độ 3×10
8
/ml trong Tween 80 nồng độ 0,05% sau 7 ngày đƣợc phun lên rệp cải đã diệt
đƣợc 67% rệp.
2. Chủng 485 thuộc loài Lecanicillium lecanii theo phân tích và so sánh trình tự gene
28S rRNA.
3. Điều kiện cho sự sinh bào tử tối đa của chủng L. lecanii 485 trong môi trƣờng rắn
là: lên men 8 ngày ở 30°C, chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày với cơ chất bột lõi ngô/bột ngô
(1:1, w/w) có độ dày 27,5 mm, độ ẩm môi trƣờng cơ chất 41%, nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
tƣơng
đƣơng 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO
4
bằng 0,035% cơ chất, KH
2
PO
4
bằng 0,1% cơ chất.
Chủng L. lecanii 485 khi lên men trong điều kiện tối ƣu, đạt đƣợc số lƣợng bào tử
(1,353 ± 0,019)×10
10
/g cơ chất.

7. Akhtar L. H., Hussain M., Iqbal R. M., Amer M., Tarig A. H. (2010), “Losses in grain yield
caused by russian wheat aphid Diuraphis noxia (Mordvilko)”, Sarhad J Agric, 26(4),
pp. 625-628.
8. Andreotti G., Hou L., Freeman L. E. B., Mahajan R., Koutros S., Coble J., Lubin J., Blair
A., Hoppin J. A., Alvanja M. (2010), “Body mass index, agricultural pesticide use,
and cancer incidence in the agricultural health study cohort”, Cancer Causes Control,
21(11), pp. 1759-1775.
9. Angelo I. C., Fernandes E. K., Bahiense T. C., Perinotto W. M., Moraes A. P., Terra A. L.,
Bittencourt V. R. (2010), “Efficiency of Lecanicillium lecanii to control the tick

12
Rhipicephalus microplus”, Vet Parasitol, 172(3-4),
pp. 317-322.
10. Arevalo J., Hidalgo-Díaz L., Martins I., Souza J. F., Castro J. M. C., Carneiro R. M. D.
G., Tigano M. S. (2009), “Cultural and morphological characterization of Pochonia
chlamydosporia and Lecanicillium psalliotae isolated from Meloidogyne mayaguensis
eggs in Brazil”, Trop Plant Pathol, 34(3),
pp. 158-163.
11. Aspelin A. L., Grube A. H. (1999), Pesticides industry sales and usage 1996 and 1997
market estimates, United States EPA.
12. Barson G. (1976), “Laboratory studies on the fungus Verticillium lecanii, a larval
pathogen of the large elm bark beetle (Scolytus scolytus)”, Ann Appl Biol, 83, pp. 207-
214.
13. Baysal Z., Uyar F., Aytekin C. (2003), “Solid state fermentation for production of α-
amylase by a thermotolerant Bacillus subtilis from hot-spring water”, Process
Biochem, 38, pp. 1665-1668.
14. Blair A., Freeman L. B. (2009), “Epidemiologic studies of cancer in agricultural
populations: observations and future directions”, J Agromed, 14,
pp. 125-131.
15. Brar N. S., Bakhetia D. R. C., Sekhon B. S. (1987), “Estimation of losses in yield of

“Characterization and virulence of Lecanicillium lecanii against different aphid
species”, Bio Control, 54, pp. 825–835.
25. El-Defrawi G. M., El-Harty E. H. (2009), Injury levels and yield loss model for the
cowpea aphid (Aphis craccivora Koch) on Vicia faba L., 6th International Symposium
of Mediterranean Group on Pesticide Research, Cairo, Egypt.
26. Feng K. C., Liu B. L., Tzeng Y. M. (2000), “Verticillium lecanii spore production in
solid-state and liquid-state fermentations”, Bioprocess Biosyst Eng, 23, pp. 25-29.
27. Gao L., Liu X. Z. (2009), “A novel two stage cultivation method to optimize carbon
concentration and carbon to nitrogen ratio for sporulation of biocontrol fungi”, Folia
Microbiol, 54(2), pp. 142-146.
28. Gary C. J., Liberty P. A., Jocelyn B. P. (2005), “Effect of nitrogen fertilizer on the
intrinsic rate of increase of the rusty plum aphid, Hysteroneura setariae (Thomas)
(Homoptera: Aphididae) on rice (Oryza sativa L.)”, Environ Entomol, 34(4), pp. 938-
943.
29. Gindin G., Levski S., Glazer I., Soroker V. (2006), “Evaluation of the entomopathogenic
fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against the Red Palm Weevil
Rhynchophorus ferrugineus”, Phytoparasitica, 34(4), pp. 370-379.
30. Gopalakrishnan C. (1989), “Susceptibility of cabbage diamondback moth Plutella
xylostella L. to the entomofungal pathogen Verticillium lecanii (Zimmerman)”, Viegas
Current Science, 58(22), pp. 1256-1257.
31. Grube A., Donaldson D., Kiely T., Wu L. (2011), Pesticides industry sales and usage,
2006 and 2007 market estimates, United States EPA.

14
32. Guclu S., Ak K., Eken C., Akyol H., Sekban R., Beytut B., Yildirim R. (2010),
“Pathogenicity of Lecanicillium muscarium against Ricania simulans”, Bull Insectol,
63(2), pp. 243-246.
33. Hall R. A. (1981), “A new insecticide against greenhouse aphids and whitefly: the fungus
Verticillium lecanii”, Ohio Florists’ Assoc Bull, 626, pp. 3-4.
34. Hart K., Pimentel D. (2002), “Public health and costs of pesticides”, Encyclopedia of Pest

(Orthoptera: Acrididae) inoculated with a Canadian isolate of the fungus Verticillium
lecanii”, J Invertebr Pathol, 52, pp. 335-342.
44. Kaiser W. J., Danesh D. (1971), “Biology of four viruses affecting Cicer arietinzrm in
Iran”, Phytopathology, 61, pp. 372-375.
45. Kiely T., Donaldson D., Grube A. (2004), Pesticides industry sales and usage, 2000 and
2001 market estimates, United States EPA.
46. Kim H. Y., Lee H. B., Kim U. C., Kim I. S. (2008), “Laboratory and field evaluations of
entomopathogenic Lecanicillium attenuatum CNU-23 for control of green peach aphid
(Myzus persicae)”, J Microbiol Biotechnol, 18(12), pp. 1915-1918.
47. Kim J. J., Lee M. H., Yoon C. S., Kim H. S., Yoo J. K., Kim K. C. (2001), “Control of
cotton aphid and greenhouse whitefly with a fungal pathogen”, Biological Control of
Greenhouse Pests, Food & Fertilizer Technology Center, Taipei, Taiwan, pp. 8-15.
48. Kleespies R. G., Zimmermann G. (1992), “Production of blastospores by three strains of
Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorok. In submerged culture”, Biocontrol Sci
Technol, 2, pp. 127-135.
49. Kope H. H., Alfaro R. I., Lavallée R. (2008), “Effects of temperature and water activity on
Lecanicillium spp. conidia germination and growth, and mycosis of Pissodes strobi”,
BioControl, 53, pp. 489-500.
50. Le V. V., Nguyen D. D., Le K. A., Pham K. S., Tetsu A. (2011), “Sex pheromone
components and control of the citrus pock caterpillar, Prays endocarpa, found in the
Mekong Delta of Vietnam”, J Chem Ecol, 37(1),
pp. 134-140.
51. Mcgavin G. C., Preston-Mafham K. (1993), Bugs of the World, Of the World Series, Facts
on File, New York.
52. Miller G. T. (2002), Living in the Environment: Principles, Connections, and Solutions
(12th Ed.), Wadsworth/Thomson Learning, Belmont, Califorlia.
53. Milner R. J. (1997), “Prospects for biopesticides for aphid control”, Biocontrol, 42(1-2),
pp. 227-239.
54. Moazami N. (2002), “Biopesticides production”, Encyclopedia of Biological physiological
and Health Sciences, Encyclopedia Of Life Support Systems, pp. 1-52.

Ethics, Chapman & Hall, New York, pp. 47-84.
66. Pimentel D., Stachow U., Takacs D. A., Brubaker H. W., Dumas A. R., Meaney J. J.,
O’neil J. A. S., Onsi D. E., Corzilius D. B. (1992), “Conserving biological diversity in
agricultural/forestry systems”, Bioscience, 42,
pp. 354-362.
67. Piper R., Shanahan M. (2007), Extraordinary Animals: An Encyclopedia of Curious and
Unusual Animals, Greenwood Press, United States.
68. Raimbault M. (1998), “General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation”, Electron J Biotechnol, 1(3), pp. 1-15.
69. Razaq M., Mehmood A., Aslam M., Ismail M., Afzal M., Ali-Shad S. (2011), “Losses in
yield and yield components caused by aphids to late sown Brassica napus L., Brassica

17
juncea L. and Brassica carrinata A. at Multan, Punjab (Pakistan)”, Pak J Bot, 43(1),
pp. 319-324.
70. Richter E. D. (2002), “Acute human pesticide poisonings”, Encyclopedia of Pest
Management, Dekker, New York, pp. 3-6.
71. Ridgway R. L., Tinney J. C., Macgregor J. T., Starlert N. J. (1978), “Pesticide use in
agriculture”, Environ Health Perspect, 27, pp. 103-112.
72. Riedell W. E., Catangui M. A., Beckendorf E. A. (2009), “Nitrogen, fixation, ureide, and
nitrate accumulation responses to soybean aphid injury in Glycine max”, J Plant Nutr,
32(10), pp. 1674-1686.
73. Rombach M. C. (1989), “Production of Beauveria bassiana [Deuteromycotina:
Hyphomycetes] sympoduloconidia in submerged culture”, Entomophaga, 34, pp. 45-
52.
74. Shi Y., Xu X., Zhu Y. (2009), “Optimization of Verticillium lecanii spore production in
solid-state fermentation on sugarcane bagasse”, App Microbiol Biotechnol, 82, pp.
921-927.
75. Shingleton A. W., Sisk G. C., Stern D. L. (2003), “Diapause in the pea aphid
(Acyrthosiphon pisum) is a slowing but not a cessation of development”, BMC Dev

87. Zhou P., Zhao Y., Li J., Wu G., Zhang L., Liu Q., Fan S., Yang X., Li X., Wu Y. (2011),
“Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 Chinese total diet
study”, Environ Int, Epub ahead of print, available at
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412011001632.