Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một
số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu
(Myristica Fragrans) Nguyễn Thị Chinh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: TS. Phương Thiện Thương
Năm bảo vệ: 2011

Abstracts. Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của 04 hoạt chất là các lignan phân
lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans là acid meso-dihydroguairetic,
macelignan, fragransin A2, nectandrin B trên mô hình tế bào 2D, spheroid và in
vivo. Kết quả như sau: Trong 04 hoạt chất thì acid meso-dihydroguairetic có hoạt
tính kháng u mạnh nhất khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị
IC50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng
tế bào ung thư phổi H358 với giá trị IC50 nhỏ nhất là 10,11 µM. Chế phẩm không
gây độc cho dòng tế bào thường MDCK khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM). Ở mô
hình spheroid, acid meso-dihydroguairetic có tác dụng rõ rệt trong việc làm giảm
thể tích và gây tan khối cầu spheroid MCF7. Trong in vivo, acid meso-
dihydroguairetic gây tiêu hết u trên chuột nhắt swiss đến 50% ở liều thử thuốc cao
nhất 1g/kg thể trọng, và đạt tỷ lệ 30% ở hai liều thấp hơn là 0,5 và 0,2g/kg thể trọng
đồng thời làm tăng thời gian sống thêm ở chuột so với đối chứng không sử dụng
chế phẩm ở tất cả 3 liều lượng thử.

Keywords. Hoạt chất phân lập; Hạt nhục đậu khấu; Chống ung thư; Hóa sinh học

Content

Nhưng cho đến nay những nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của hạt và các lignan
phân lập từ hạt ở Việt Nam và thế giới mới có rất ít [27].
Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống
ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans” với các
mục đích chính như sau:
- Thử hoạt tính chống ung thư của các hoạt chất lignan phân lập được trên mô
hình nuôi cấy tế bào 2D.
- Tạo mô hình và nghiên cứu tác dụng chống ung thư của lignan có tác dụng
chống ung thư mạnh nhất (trong các lignan đã thử nghiệm 2D) trên mô hình 3D và in
vivo.
Ung thư không phải chỉ là một loại bệnh mà là khoảng trên 200 loại bệnh khác
nhau [34]. Mỗi loại có nguyên nhân riêng của nó, nhưng đều có nguồn gốc chung từ việc
tế bào bị đột biến gen [34]. Năm 1953, lần đầu tiên tế bào ung thư được quan sát dưới
kính hiển vi điện tử. Những thành tựu nghiên cứu ở mô hình tế bào cho đến nay là cơ sở
chắc chắn cho nhận định của giáo sư Arnold Graffi “vấn đề của ung thư thực chất là vấn
đề của tế bào học”. Vì vậy muốn điều trị ung thư phải hiểu được cơ sở tế bào học của nó
[8, 34]. Các đặc điểm nổi bật chung của tế bào ung thư là tế bào bị đột biến gen, có khả
năng sự tăng sinh vô hạn, không kiểm soát được, có khả năng xâm lấn và phát triển ở các
cơ quan, tổ chức khác của cơ thể (sự di căn), có khả năng tăng sinh mạch máu [13, 34].
Bệnh ung thư bắt đầu từ khi có một tế bào bắt đầu vượt qua sự kiểm soát của cơ
thể, bị đột biến gen, phát triển không ngừng và hình thành một đám tế bào có chung đặc
điểm là phát triển vô kiểm soát, xâm lấn và chèn ép các mô xung quanh. Có rất nhiều
nguyên nhân làm chuyển dạng tế bào lành thành tế bào ung thư, bao gồm: các tác nhân
vật lý (chủ yếu là tia bức xạ ion hóa), các tác nhân hóa học, các virus, một số bệnh viêm
mạn tính, nhiễm trùng lâu ngày, rối loạn nội tiết, rối loạn hoạt động enzyme và nhiều vấn
đề dinh dưỡng liên quan. Các tác nhân này gây ảnh hưởng sâu sắc đến cơ cấu di truyền
phân tử của tế bào, làm thay đổi khả năng trao đổi chất, năng lượng và thông tin với môi
trường. Ngoài ra, ung thư còn có thể do yếu tố di truyền bẩm sinh
Quá trình hình thành khối u từ tế bào ung thư phải trải qua nhiều giai đoạn. Thời
gian từ tế bào ung thư khởi đầu đến khi xuất hiện một u có thể nhận biết gọi là thời kì

hình in vitro
a, Nạp tế bào
8000 tế bào trong 180 µl môi trường nuôi cấy DMEM (hoặc RPMI) tùy thuộc
từng dòng tế bào với hàm lượng 10% FBS, được nạp vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96
giếng, sau đó được ủ trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37
0
C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong
24h trước khi tiến hành ủ với hoạt chất.
b, Ủ với thuốc thử
Sau 24h nuôi cấy, đĩa thí nghiệm được cho thêm vào mỗi giếng 20µl dịch thuốc
đã pha trong môi trường nuôi cấy có nồng độ đặc gấp 10 lần liều thử. Tế bào được ủ với
các chất theo 5 nồng độ 30μM -10μM -3μM -1μM – 0,3μM trong 48h. Mỗi nồng độ được
lặp lại 4 lần. Sau đó đem cố định với TCA.
c, Nhuộm với SRB
Protein tổng số của tế bào sau khi cố định bằng TCA 50% được nhuộm trong
10 phút bằng dung dịch SRB 4% với lượng 100µl/giếng ở nhiệt độ phòng. Lượng SRB
dư thừa được rửa trôi bằng dung dịch 1% axit axetic, lặp lại 5 lần. Sau đó hong khô ở
nhiệt độ phòng.
d, Hòa tan thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm đã bám vào protein được thôi ra bằng cách lắc nhẹ trên máy lắc với
100 µl dung dịch 10mM tris-base/giếng.
e, Đo mật độ quang học
Mật độ quang học của dung dịch SRB vừa được thôi ra trong các giếng được xác
định bằng máy Microplate reader Model 680 (BioRad) ở bước sóng 540 nm.
f, Tính toán số liệu và ghi kết quả
Dựa vào giá trị mật độ quang học đo được, xác định % tỷ số tăng sinh A của tế
bào theo công thức sau:
A (%) =
T
VH

sung 20% FBS, ủ trong tủ ấm 37
0
C, 5% CO
2
. Nuôi tế bào đến khi tế bào bám
mặt đĩa nuôi cấy khoảng 75-90% thì tiến hành thu tế bào.
 Thu tế bào: sử dụng trypsin để tách tế bào khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. Xác định
số lượng tế bào bằng buồng đếm Thoma.
Bước 3: Tạo spheroid
 Nhỏ 20µl tế bào (nồng độ 5000TB/20µl) lên nắp đĩa
 Đậy nắp đĩa vào đĩa agarose đã chuẩn bị trước
 Nuôi trong tủ ấm 37
0
C, 5% CO
2
.
 Sau 2 ngày tiến hành hạ giọt treo xuống nền agarose.
Thiết kế thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất meso-dihydroguairetic acid trên
spheroid MCF7
Sau khi hạ giọt spheroid, để spheroid phát triển ổn định, sau khoảng 5-7 ngày tiến
hành tra mẫu hoạt chất với 5 nồng độ khác nhau: 30, 20, 15, 10, 5 µM. Đồng thời tiến
hành tra taxol ở các giếng đối chứng thử với taxol với 5 nồng độ là: 30; 3; 0,3; 0,03;
0,003 µg/ml (Bảng 4).

Bố trí thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất 1 trên mô hình spheroid MCF7
0,003
C
M
VH
30
20
15
10
5
30
3
0,3
0,03
0,003
D
M
VH
30
20
15
10
5
30
3
0,3
0,03
0,003
E
MT
VH

H
MT
VH 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Gây u
Chuột 05 tuần tuổi (trọng lượng trung bình 18 - 20g) sau khi được bắt về 01 ngày,
được tiến hành gây u.
Dùng sơranh, kim 18G tiêm 0,2ml huyền dịch tế bào Sarcoma180 (tương đương
10
6
tế bào) vào dưới da vùng ngực (lệch về phía bên phải chuột) để tạo u rắn trên chuột.
Phân lô
Sau 05 ngày cấy truyền, quan sát thấy khối u rắn đã xác định rõ, tiến hành phân
lô, đo kích thước khối u và trọng lượng.
Chuột được chia làm 07 lô:
 01 Lô Đối chứng sinh học - viết tắt là ĐCSH: chuột khỏe mạnh bình thường,
không cấy truyền TBUT.
 01 Lô Đối chứng ung thư - viết tắt là ĐCUT: chuột được cấy truyền TBUT.
 01 Lô Đối chứng ung thư uống dung môi - viết tắt là ĐCDM: chuột được cấy
truyền TBUT, uống dung môi là dầu gấc.
 01 Lô Đối chứng ung thư uống 6-MP – viết tắt UT+6-MP: chuột được cấy
truyền TBUT, uống 6-MP pha trong nước cất.
 03 lô đối chứng ung thư uống hoạt chất 1 - viết tắt là UT+1 (1g/kg); UT+1
(0,5g/kg); UT+1 (0,2g/kg): chuột được cấy truyền TBUT, uống hoạt chất 1
pha trong dung môi dầu gấc với nồng độ hoạt chất lần lượt là 1g; 0,5g; 0,2g
hoạt chất trên 1kg thể trọng chuột.
Cách cho uống
Dùng sơranh (có kim cho uống dài, đầu tù) cho sâu vào trong cổ họng chuột để
tránh hiện tượng chuột nhè thuốc ra ngoài, cho chuột uống vào các ngày thứ 2, 3, 5, 6
trong tuần.
Liều uống
Chất 1: 3 liều uống tương ứng với 3 lô là 1g; 0.5g; 0.2g/kg thể trọng tương đương với
20; 10; 4mg/con/lần.
6-MP: liều uống 0,96 mg/con/lần.

ngày thứ 4 thì thể tích khối cầu spheroid gần như không đáng kể (chỉ còn vài 6-
7% so với ngày thứ nhất).
 meso-dihydroguairetic acid gây tiêu hết u đến 50% trên chuột nhắt trắng Swiss
mang u rắn Sar180 ở liều thử thuốc cao nhất 1g/kg thể trọng, và đạt tỷ lệ 30% ở
hai liều thấp hơn là 0,5 và 0,2g/kg thể trọng. Chất thử còn có tác dụng làm tăng
thời gian sống thêm ở chuột so với đối chứng không sử dụng chế phẩm ở tất cả 3
liều lượng thử, kéo dài nhất là liều 1g/kg thể trọng. Chuột ở lô ĐCUT chỉ sau 35
ngày kể từ khi tạo u chuột đã chết hoàn toàn, ở các lô sử dụng chất số 1 còn 30%
số chuột vẫn sống đến ngày thứ 60.
Những kết quả nghiên cứu trên có thể kết luận hoạt chất meso-dihydroguairetic acid
(1) có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư in vitro và in vivo. Tuy nhiên
cơ chế tác dụng của hoạt chất này vẫn chưa được biết rõ. Hy vọng những kết quả này sẽ
là tiền đề cho việc nghiên cứu tiếp theo về cơ chế tác dụng và định hướng phát triển của
hoạt chất 1 trong tương lai.

References
Tiếng Việt
1. Đỗ Trung Đàm (1995), Thuốc chữa ung thư, NXB Y học, Hà Nội.
2. Lê Xuân Hải (2009), Đánh giá độc tính và tác dụng kích thích miễn dịch, chống
gốc tự do của cao thuốc thảo dược VID, Luận án tiến sĩ.
3. Hiệp hội chống ung thư UICC (1999), Ung thư học lâm sàng, NXB Y học, Hà
Nội.
4. Bùi Văn Lệ, “Ảnh hưởng chất điều hoà tăng trưởng thực vật và đường saccarose
lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công
nghệ, 9 (6), tr59.
5. Đỗ Tất Lợi (2003), Các cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
6. Chu Văn Mẫn (2009), Tin học trong công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
7. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học trên người và động
vật, NXB Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Thị Quỳ (1993), Gây tạo mô hình u báng thực nghiệm và thử tác dụng

Sugiyama, K. (2003), “Hepatoprotective effect of myristicin from nutmeg
(Myristica fragrans) on lipopolysaccharide/d-galactosamine-induced liver injury”,
J. Agric. Food Chem., 51, 1560-1565.
22. Laboratory, T.J. (2008), Mouse Models for Cancer Research.
23. Olajide, O.A., Ajayi, F.F., Ekhelar, A. I., Awe, S.O., Makinde, J.M., Alada, A.R.
(1999), “Biological effects of Myristica fragrans (nutmeg) extract”, Phytother.
Res., 13, 344-345.
24. Oliveros – Belardo, V.A., Masilugan, V., Cardeno, F., Devera, E., Delacruz, E.,
Valmonte. J. (1972), “Possible antitumor conitituent of Carica papaya”, Asia
J.Pham.r, 26-9.
25. Ozaki, Y., Soedigdo, S., Wattimena, Y.R., Suganda, A.G. (1989),
“Antiinflammatory effect of mace, aril of Myristica fragrans Houtt., and its active
principles”, Jpn. J. Pharmacol., 49, 155-163.
26. Park, S., Lee, D.K., Yang, C. (1998), “Inhibition of fos-jun-ADN complex
formation by meso-Dihydroguaireic acid and in vitro cytotoxic effect of cancer
cells”, Cancer Lett., 127 (1-2), 23 -28.
27. Phuong Thien Thuong., Nguyen Trang Thuy., Dao Trong Tuan., Nguyen Minh
Khoi., Won Keun Oh. (2009), “Major lignans from the seeds of Myristica
fragrans (Nutmeg)”, Tạp chí Dược liệu, 14(2), 82-85.
28. Ram, A., Lauria, P., Gupta, R., Sharma, V.N. (1996), “Hypolipidatemic effect of
Myristica fragrans fruit extract in rabbits”, J. Ethnopharmacol., 55, 49-53.
29. Rolf Bjerkvig, Ph.D. (1992), Spheroid culture in cancer research, Illustrated.
30. Sharma, A., Mathur, R., Dixit, V.P. (1995), “Prevention of hypercholesterolemia
and atherosclerosis in rabbits after supplemientation of Myristica fragrans seed
extract”, Indian J. Physiol. Pharmacol., 39, 407-410.
31. Sohn, J.H., K.L., Choo, J.H., Hwang, J.K. (2007), “Macelignan protects HepG2
cells against tert-butylhydroperoxide-induced oxidative damage”, Biofactors, 29,
1-10.
32. Suckow, M.A. (2001), The laboratory mouse, A Volume in The Laboratory
Animal Pocket Reference Series.