Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng
nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis

Nguyễn Thành Đạt

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: GS-TS Đỗ Ngọc Liên
Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: phương pháp gây
đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELIS, phương pháp tinh sạch IgG từ
huyết thanh chuột, kỹ thuật Western Blot … Tạo kháng thể đa dòng kháng
lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein
này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp). Kiểm tra khả năng phản ứng
của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus
anthracis.

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Kháng thể; Vi khuẩn than

Content
I. TỔNG QUAN
Trong lịch sử phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học, nghiên cứu ứng dụng miễn dịch học đã
được đưa vào thực tiễn từ rất sớm. Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng
thành công các sản phẩm của hệ miễn dịch vào các lĩnh vực trong cuộc sống như trong Y học điều
trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát hiện bệnh, phát hiện các tác nhân vi sinh vật, các loại độc
chất, ma túy, khoa học hình sự, phát hiện ô nhiễm môi trường… với nhiều phương pháp như
ELISA, Western Blot, Dot Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh
dạng sắc ký miễn dịch)…Các kỹ thuật trên đều sử dụng đến sản phẩm của hệ miễn dịch là kháng
thể đa dòng và kháng thể đơn dòng.

tiếng như: Merck, BCE…đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên
chuột, Kỹ thuật ELIS, Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột, Kỹ thuật Western Blot….


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch
Trước khi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của
protein BclA tái tổ hợp nhằm tránh khả năng làm giảm hiệu suất tạo kháng thể đa dòng kháng lại
protein quan tâm theo phương pháp điện di SDS-PEGE 12.5%.
Mẫu BclA tái tổ hợp được pha theo tỷ lệ 1:2 với hỗn hợp dye (950μl đệm SDS-reducing và
50μl β – mercaptothanol). Mẫu được đun nóng 95
0
C trong 5-10 phút và được đổ vào giếng. Cài đặt
máy chạy 100v, thời gian 1h30 phút. Hình 1: Kết quả điện di protein BclA tái tổ hợp trên gel 12.5%
M: Marker prestain (Fermentas)
1: Mẫu BclA tái tổ hợp chưa tinh sạch qua cột Talon (Niken) HP

Kết quả thử nghiệm như hình 2. Trên các que thử số 1 và số 2, tại các vị trí T
1
và T
2
, tương
ứng với vị trí được trải protein BclA tái tổ hợp và dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than, không thấy xuất
hiện vạch mầu đỏ hồng. Điều đó cho thấy trong huyêt thanh của lô chuột thử nghiệm không chứa
kháng thể kháng protein BclA dạng tái tổ hợp cũng như dạng tự nhiên. Như vậy, lô chuột trước khi
gây đáp ứng miễn dịch đã đảm bảo không bị nhiễm bệnh bởi vi khuẩn B. anthracis, từ đó cho phép
chúng tôi tiến hành những bước nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo kháng thể đa dòng kháng lại
protein tái tổ hợp BclA.

Hình 2: Kết quả kiểm tra mẫu huyết thanh
1: T
1
được trải với mẫu protein BclA
2: T
2
được trải với dịch phá vỏ bào tử
3.3. Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột.
Nhằm đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với

theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch với dung dịch hạt nano vàng có kích thước hạt là 40nm với
OD 15, nhằm kiểm tra khả năng sinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trong quá trình gây
đáp ứng miễn dịch.
Bằng phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch (Hinh 4) cho thấy kháng thể có
mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch và cộng hợp với hạt vàng nano
40nm OD 15 có khả năng nhận biết đặc hiệu với protein BclA tái tổ hợp với nồng độ 0.3mg/ml và
mật độ trải lên màng là 0,1μl/1mm. Hình 4: Que thử dạng sắc ký miễn dịch kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng BclA
Vị trí C: Trải kháng thể đa dòng Goat anti mouse
Vị trí T: Trải protein BclA tái tổ hợp
1: Huyết thanh thu tuần 1
2: Huyết thanh thu tuần 2
3: Huyết thanh thu tuần 3
4: Huyết thanh thu tuần 4
Kết quả trên cho thấy, trong dịch huyết thanh của chuột thấy có xuất hiện kháng thể kháng
lại protein BclA tái tổ hợp được biểu hiện bằng sự hiện vạch mầu hồng tại vị trí T. Tại vị trí C
chúng tôi trải kháng thể đa dòng của dê kháng lại IgG của chuột (Goat anti mouse), nhằm mục đích
kiểm tra sự hoạt động của dung dịch kháng thể đa dòng kháng protein BclA cộng hợp hạt vàng nano
40nm. Tại que thử nhứ nhất, chúng ta thấy xuất hiện mầu hồng nhạt tại vị trí T cho ta thấy sau khi

không phản ứng chéo với các protein khác (ở đây là BSA – Bovine serum albumin). Mặt khác, trên
que thử tại hai vạch T
1
và T
2
không xuất hiện vạch màu hồng cũng đồng nghĩa chứng tỏ trong dung
dịch kháng thể đa dòng kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano hạt vàng đã được block hoàn toàn các
liên kết làm cho hạt vàng không còn khả năng phản ứng với các protein nào khác.

Goat anti mouse (C)
BSA conjugated THC (T
1
)
BSA conjugated Morphine (T
2
)
Từ đó cho phép chúng tôi kết luận rằng, việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng
kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công
3.4. Tinh sạch kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp
Tuy đã thu được huyết thanh có chứa chủ yếu là kháng thể IgG nhận biết đặc hiệu với
Protein BclA tái tổ hợp, nhưng thực tế trong huyết thanh vẫn còn rất nhiều các protein không mong
muốn khác. Vì vậy, chúng tôi tiến hành sử dụng hệ thống cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP
(hãng GE Healthcare) để loại các protein không mong muốn, nhằm thu được kháng thể IgG kháng
Protein BclA tinh sạch.
Cột HiTrap™ Protein G HP (1x5ml) được cân bằng với đệm rửa cột sodium phosphate 20
mM, pH 7.0. Dung dịch huyết thanh sau khi điều chỉnh pH về pH 7.0 được đưa lên cột với tốc độ là
1ml/phút. Rửa cột bằng đệm sodium phosphate 20 mM, pH 7.0 để loại các protein không đặc hiệu
với cột với thể tích đệm rửa bằng 5 lần thể tích cột
Sau đó, tiến hành rửa chiết kháng thể IgG (đặc hiệu với cột protein G-Sepharose) bằng đệm
Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7. Các phân đoạn rửa chiết kháng thể nhanh chóng được trung hòa về pH
Hình 7: Kết quả điện di tinh sạch kháng thể đa dòng kháng protein BclA
1: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder
2: Phân đoạn tinh sạch kháng thể đa dòng
Chúng tôi tiến hành định lượng kháng thể vừa tinh sạch bằng phương pháp định lượng
protein theo phương pháp Bradford. Kết quả nồng độ kháng thể chúng tôi thu được là 1.3mg/ml.
3.5. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng kỹ
thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch
53kDa
25kDa

1 2
6.0kDa
115.5kDa
181kDa
82.2kDa
64.2kDa
48.8kDa
37.1kDa
25.9kDa
19.4kDa
14.8kDa
Với mục đích tạo được kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng nhận biết

tiến hành kiểm tra khả năng phát hiện của kháng thể đa dòng với kháng nguyên trên vỏ bào tử vi
khuẩn B. anthracis theo phương pháp Western blot.
3.6. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng
phƣơng pháp Western blot.
Sau khi có kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của kháng thể đa dòng với dung dịch phá vỏ
bào tử vi khuẩn than tự nhiên trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm đánh giá khả năng phản ứng kháng nguyên- kháng thể giữa kháng thể đa dòng kháng
protein BclA tái tổ hợp với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than (BclA tự nhiên) bằng phương pháp
western blot. Đây là một bước quan trọng để có thể khẳng định được quá trình gây tạo kháng thể đa
dòng từ kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng bắt cặp được với kháng nguyên tự nhiên từ vỏ bào tử
vi khuẩn B. anthracis.

Hình 9: Kết quả lai chuyển thấm kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể
1: Huyết thanh trước khi gây đáp ứng miễn dịch
2: Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis có trọng lượng khoảng 70kDa

1 2 3 4
6.0kDa
115.5kDa
181kDa
82.2kDa
64.2kDa
48.8kDa
37.1kDa
25.9kDa
19.4kDa
14.8kDa
3: Protein BclA tái tổ hợp
4: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder
Kết quả lai chuyển thấm miễn dịch ở hình 9 cho thấy: ở giếng 1 tương ứng với huyết thanh

C trong khoảng 8-10 tiếng, rồi tiến hành nắp các thành phần lên que
thử.
Tiến hành thử nghiệm trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch cho kết quả (Hình 10) như
mong đợi.
Hình 10: Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các
chủng vi khuẩn B. anthracis , B.cereus, B.thuringiensis, B. Subtilis.
1: Dịch phá vỏ bào tử B. subtilis
2: Dịch phá vỏ bào tử B. cereus
3: Dịch phá vỏ bào tử B. thuringiensis
4: Dịch phá vỏ bào tử B. anthracis

1 2 3 4
Goat anti mouse (C)
BclA tái tổ hợp (T1)
Dịch phá vỏ bào tử (T2)
Trên que thử với dịch phá vỏ bào tử của vi khuẩn B. subtilis, cho kết quả âm tính điều đó
chứng tỏ rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp không phản ứng chéo với các
protein trên vỏ bào tử của B. subtilis. Điều đó phù hợp với những khảo sát rằng, vỏ bào tử vi khuẩn

2. Nguyễn Văn Mùi (2001), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
B. Tiếng Anh
3. Abrami, L. N. Reig, and F. G. van der Goot (2005), “Anthrax toxin: the long and
winding road that leads to the kill”. Trends Microbiol, 13:72-78
4. Antibody purification, Handbooks from Amersham Biosciences
5. Aronson, A. I., and P. Fitz-James (1976), “Structure and morphogenesis of the
bacterial spore coat”, Bacteriol. Rev, 40:360-402.
6. Burns R. (2004), Immunochemical protocols, Methods in molecular biology, vol.
295, 3rd ed, Humana Press.
7. Charlton, S., A. J. Moir, L. Baillie, and A. Moir (1999), “Characterization of the
exosporium of Bacillus cereus”, J. Appl. Microbiol, 87:241-245.
8. Christopher Steichen, Ping Chen, John F. Kearney, and Charles L. Turnbough, Jr.
(2002), Identification of the Immunodominant Protein and Other Proteins of the Bacillus
anthracis Exosporium, Department of Microbiology, University of Alabama at
Birmingham, Birmingham, Alabama 3529.
9. Cote, C. K., C. A. Rossi, A. S. Kang, P. R. Morrow, J. S. Lee, and S. L. Welkos
(2005), “The detection of protective antigen (PA) associated with spores of Bacillus
anthracis and the effects of anti-PA antibodies on spore germination and macrophage
interactions”, Microb. Pathog, 38:209-225.
10. Edwards, K. A., H. A. Clancy, and A. J. Baeumner (2006), “Bacillus anthracis:
toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods”, Anal. Bioanal. Chem. ,
384:73-84.
11. Holtzhauer M. (2006), Basic Methods for the Biochemical Lab, Springer.
12. Petosa C., Collier R. J., Klimpel K. R., Leppla S. H., Liddington R. C. (1997),
"Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen.", Nature, 385 (6619): 833–838.
13. Rapid Lateral Flow Test Strips, Handbooks from www.millipore.com/diagnostics.
14. Redmond C., L. W. Baillie, S. Hibbs, A. J. Moir, and A. Moir (2004),
“Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis”, Microbiol., 150:355-
363.
15. Ronald E. (2003), Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley &