Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THÀNH ĐẠT
NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG
KHÁNG KHÁNG NGUYÊN ĐẶC HIỆU TRÊN VỎ
BÀO TỬ B. anthracis
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. ĐỖ NGỌC LIÊN
HÀ NỘI, 2012
1
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.2.2.
Các domain hằng định .................................................................. 16
1.2.3.
Các domain biến thiên .................................................................. 17
1.2.4.
Các lớp kháng thể ......................................................................... 17
1.2.5.
Phân loại kháng thể ...................................................................... 18
1.2.6.
Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng ... 19
1.3.
Kháng nguyên ................................................................................................ 21
1.4.
Tá chất ............................................................................................................ 22
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 24
2.1.
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
2.2.3.
Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột .................... 27
2.2.4.
Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ....................... 28
2.2.5.
Điện di protein trên gel polyacrylamid 12,5% ............................. 29
2.2.6.
Kỹ thuật Western Blot ................................................................... 30
2.2.7.
Phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch . .............. 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 34
3.1.
Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trước khi gây đáp ứng
miễn dịch ................................................................................................................... 34
55
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
MỞ ĐẦU
Trong lịch sử phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học, nghiên cứu ứng dụng miễn
dịch học đã được đưa vào thực tiễn từ rất sớm. Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình
nghiên cứu ứng dụng thành công các sản phẩm của hệ miễn dịch vào các lĩnh vực trong
cuộc sống như trong Y học điều trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát hiện bệnh,
phát hiện các tác nhân vi sinh vật, các loại độc chất, ma túy, khoa học hình sự, phát
hiện ô nhiễm môi trường… với nhiều phương pháp như ELISA, Western Blot, Dot
Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh dạng sắc ký
miễn dịch)…Các kỹ thuật trên đều sử dụng đến sản phẩm của hệ miễn dịch là kháng
thể đa dòng và kháng thể đơn dòng.
Ngày nay, các vi sinh vật nguy hiểm trong đó có vi khuẩn than (B. anthracis )
đã và đang được sử dụng để chế tạo vũ khí sinh học nhằm mục đích khủng bố. Hiện
nay, trên thế giới đã xuất hiện nhiều test nhanh dạng sắc ký miễn dịch đã được thương
mại hóa. Chúng có ưu điểm là thời gian cho kết quả nhanh chóng, độ chính xác cao,
nhưng giá thành của các loại test này còn ở mức cao và thời gian nhập khẩu lâu. Mặt
khác, ở Việt Nam, các vi sinh vật này chủ yếu được phát hiện qua các phương pháp
PCR, ELISA...Nhược điểm của các phương pháp này là cần một thời gian lâu để cho
kết quả. Do đó, cần phải có công cụ để sàng lọc nhanh nhằm phát hiện sớm sự có mặt
các tác nhân vi sinh vật này.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ
bào tử B. anthracis.”
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Vi khuẩn B. anthracis
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis
B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi khuẩn gây
bệnh. Vào năm 1877, R. Koch đã nuôi vi khuẩn này dưới dạng chủng thuần khiết,
chứng minh được khả năng hình thành bào tử của nó và gây được bệnh than thực
nghiệm bằng cách cấy nó vào cơ thể động vật.
Vi khuẩn than thuộc loài Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus là các trực
khuẩn Gram dương, có bào tử, kỵ khí tuỳ tiện. Các vi khuẩn này gồm nhiều loài, đa số
không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (B. cereus), một số có lợi
cho con người (B. subtilis , B. thuringiensis, B. mycoides). B. anthracis có đặc điểm
khác biệt với 3 loài trực khuẩn hiếu khí có bào tử trên là ở tính có độc lực của nó. B.
anthracis có plasmids pXO1; pXO2 và plasmid mã hoá capsule, vỏ chỉ hình thành
trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, hoặc được nuôi cấy trong môi trường dinh
dưỡng 0,7% Natri bicarbonat, ở nhiệt độ 37C trong điều kiện giàu CO2 (20%). [3]
Về mặt hình thái, vi khuẩn than hình thẳng, hai đầu vuông, có kích thước từ
11,5 310m, thường xếp thành từng chuỗi giống như cây tre, bắt màu Gram (+). Ở
điều kiện ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn hình
thành bào tử, nằm giữa thân và không làm thay đổi hình thể vi khuẩn. Trên động vật bị
bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt vi khuẩn có vỏ. Trong môi trường lỏng vi
khuẩn không di động. [5]
Vi khuẩn B. anthracis
Bào tử vi khuẩn B. anthracis
4
so với các chủng
B. anthracis
cereus…[9,10]
5
tương tự
như
B.
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
Hình 1: Nguyên lý gây bệnh than của vi khuẩn B. anthracis [3 ]
Trước đây việc chẩn đoán xác định B. anthracis trong phòng thí nghiệm chủ yếu
dựa vào việc phát hiện hình thái học và đặc điểm sinh học. Các kỹ thuật DNA gần đây
đáp ứng được yêu cầu phát hiện chính xác, cho phép phân biệt B. anthracis với các loại
trực khuẩn khác trong “nhóm B. cereus” như B. cereus, B. thuringiensis và B.
mycoides...Đó là dựa vào sự có mặt của hai plasmids lớn (pXO1; pXO2) của trực
khuẩn than chứa gen độc lực. [3,7]
1.1.2. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B. anthracis .
Bào tử vi khuẩn B. anthracis được hình thành trong môi trường thiếu các chất
dinh dưỡng thiết yếu. Trong quá trình hình thành này sẽ có một sự phân chia không đối
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
Ở hình 3a, là cấu tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis , có lớp ngoài cùng là áo
bào tử (Oc: outer coat layer). Ở lớp này tập trung chủ yếu các protein (chiếm khoảng
30% protein bào tử). Ước tính có khoảng 70 protein trên lớp áo bào tử, phần lớn các
protein này là đặc hiệu cho chủng B. subtilis , người ta thường dựa vào các protein đó
để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn này. Khác với vi khuẩn B. subtilis có lớp áo bào tử
dày với lớp bên trong sáng và lớp bên ngoài tối, vi khuẩn than có áo bào tử mỏng. Lớp
này được phân cách với lớp ngoài cùng bởi khoảng giữa (Is: interspace). Đối với các
chủng B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis, B. mycoides và một số thuộc nhóm
Clostridia thì lớp ngoài cùng là vỏ bào tử. Hình 3b và hình 4 mô tả cấu tạo bào tử của
vi khuẩn than.
Hình 4: Cấu tạo các lớp của bào tử vi khuẩn than [3,5]
Cấu tạo lớp ngoài cùng của bào tử gồm 2 lớp sau: lớp cơ bản (Bl: basal layer) và
một phần bên ngoài giống như các sợi lông (Hn: hair-like nap). Khi quan sát dưới kính
hiển vi điện tử và dùng nhiễu xạ X-quang, người ta thấy lớp cơ bản dày khoảng 190A0
được hình thành từ các lớp mỏng hơn. Lớp cơ bản gồm 4 tấm kết tinh, mỗi tấm có cấu
trúc lỗ có hình lục giác. Ở B. cereus và B. anthracis thì lớp cơ bản dày khoảng 2030nm. [14].
Phần lông bao quanh bên ngoài là một glycoprotein gọi là BclA (Bacillus
collagen-like protein of anthracis). Phần cấu trúc của BclA sẽ được mô tả cụ thể ở phần
8
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
sau. Vỏ bào tử chiếm khoảng 2% khối lượng của bào tử và có khoảng 50% protein,
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
Hình 5: Các protein trên vỏ bào tử của một vài loại vi khuẩn [ 14 ]
10
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
Protein nhóm F như BclA, ExsB, ExsC, ExsD,BxpB,... là các protein có trọng
lượng phân tử cao. Có thể kể đến những đặc điểm cơ bản của một số protein thuộc
nhóm này. BxpB được tìm thấy ở lớp cơ bản nhờ đánh dấu miễn dịch huỳnh quang
bằng vàng. Protein này tạo phức liên kết hoá trị mạnh với BclA, các protein khác ở lớp
cơ bản và lớp lông bên ngoài gồm ExsY và CotY. Khi BxpB được tách chiết từ bào tử
bằng SDS, nó được tách ở cả dạng đơn phân và dạng phức hệ khối lượng phân tử lớn
với BclA. BxpB bị đột biến không có khả năng bám với lông bên ngoài, mặc dù BclA
vẫn được tổng hợp bình thường. Thiếu BxpB dẫn đến bào tử nảy mầm nhanh hơn. Một
nhóm các protein, như BxpA, BxpB (còn gọi ExsFA), BxpC, ExsC... chỉ được tìm thấy
ở các vi sinh vật thuộc B. cereus (Bảng 1, nhóm F). Điều này cho thấy vỏ bào tử ở các
sinh vật khác được gắn với lớp cơ bản bằng một nhóm các protein khác. Protein trên vỏ
bào tử của vi khuẩn mang tính đặc hiệu thường được dùng như maker chỉ thị sự có mặt
của vi khuẩn đó [14].
1.1.4. BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định sự có mặt của vi khuẩn
than
Như đã nói ở trên, một trong những thành phần chính của vỏ bào tử là lớp lông
cho tính kỵ nước của cả bào tử. Giữa các aa 41-232 là trình tự lặp lại
((GPT)5GDTGTT)2 đặc trưng cho BclA. Vùng lặp lại của BclA rất đa dạng, cũng như
phần đầu N và đầu C có trình tự đa hình, cho phép phân biệt giữa các loài và các
chủng. Sự khác nhau về số lượng lặp lại cũng tương ứng với độ dài của lông trên vỏ
bào tử. Các đột biến BclA sẽ làm mất khả năng nhìn thấy lông ở ngoài bề mặt vỏ bào
tử. Vùng kết thúc đầu C (CTD: C-terminal domain ) gồm 134 acid amin là yếu tố cần
thiết để hình thành cấu trúc xoắn ba lần (triple) của protein BclA. CTD có thể tạo thành
dạng xoắn gồm 3 phần CTD một cách tự nhiên. Domain này nằm hướng ra phía ngoài
lớp vỏ bào tử và là phần lộ ra ngoài chủ yếu của BclA. [17,19,20]
12
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
Hình 7: Cấu trúc 3D của phân tử BclA [ 12,16,17 ]
BclA tái tổ hợp kháng được một số protease nhưng rất dễ bị tác động bởi collagenase,
trong khi đó BclA liên kết đường (glycosylated BclA) tự nhiên có thể kháng lại cả 2
enzyme này. Xử lý BclA tái tổ hợp bằng enzyme collagenase làm phân hủy các acid
amin ở hai đầu của vùng giống collagen nhưng vùng CTD không bị phân hủy.
BclA được dự đoán là có cấu trúc dạng kẹo que (lollipop), phần CTD tạo thành
đầu xoắn của quả cầu protein. Domain CTD có dạng hình cầu và có độ tương đồng cao
với protein bổ thể C1q và yếu tố hoại tử khối u. Cả BclA và bổ thể C1q đã được chứng
minh là có khả năng tương tác với thành phần SP-C (một thành phần chính trên bề mặt
phế nang phổi)
Cấu trúc và vai trò của BclA trong bệnh học của B. anthracis đã được làm sáng
tỏ. Khi điện di, BclA di chuyển giống protein có kích thước >70kDa, lớn hơn nhiều so
với kích thước 34 kDa khi giải trình tự acid amin. Điều này có thể là do thành phần
Hình 8: Cấu trúc của Tetrasaccharide [20 ]
Sự lặp lại của GPT được ổn định bởi sự glycosyl hoá. BclA tái tổ hợp được biểu
hiện trong E.coli không bị glycosyl hoá. BclA hiếm khi không bị glycosyl hoá vì nó
gián tiếp liên kết với sản phẩm của quá trình glycosyl hoá này. Khi các protein có
14
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
nguồn gốc ở bào tử được xử lý với acid trifluoromethanesulfonic (TFMS) nhằm loại
bỏ sự glycosyl hoá, protein vẫn giữ lại một phần đường.
Bản chất quá trình glycosyl hoá tự nhiên của BclA đóng một vài trò quan trọng
trong việc liên kết bào tử với các phân tử carbohydrate của màng các tế bào trình diện
kháng nguyên ở động vật. Điều này cũng có thể bảo vệ vỏ bào tử khỏi sự glycosyl hoá ,
tách enzyme ra khỏi bào tử để giúp loại trừ một số phân tử tiếp cận với bào tử.
Bào tử bị đột biến BclA cũng không thay đổi đáng kể độc tính với mô hình gây
bệnh ở chuột, tuy nhiên thời gian mang bệnh sẽ biến đổi. Trong đa số các tài liệu đã
được công bố thì BclA luôn là đích quan tâm của các nhà khoa học, vì kháng nguyên
bề mặt này hay được sử dụng để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn than [20].
1.2.
Đại cương về kháng thể
1.2.1. Kháng thể
Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein) có hình
dạng hơi giống chữ Y, do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (plasma cell biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ,
nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể. Do đó, phần "chân"
của chữ Y còn được gọi là Fc (tức là phần hoạt động sinh học của kháng thể F:
fragment, c: cristallisable) thường được liên kết với các thụ thể tế bào miễn dịch.
16
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
1.2.3. Các domain biến thiên
Mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V, variable domain) ở đầu tận hai
"cánh tay" của chữ Y. Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1
domain biến thiên trên các chuỗi nhẹ kappa và lambda (VL) tạo nên vị trí nhận diện và
liên kết với epitope của kháng nguyên ( phần kháng thể liên kết với kháng nguyên còn
gọi là paratopee). Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên. Hai vị
trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có thể gắn được với 2 kháng nguyên
giống nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần liên kết kháng
nguyên, F: fragment, ab: antigen binding). Domain của kháng nguyên gắn vào kháng
thể gọi là epitope
Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều và biểu hiện đa
dạng giữa các kháng thể. Chính sự biến thiên đa dạng này giúp cho hệ thống các kháng
thể nhận biết được nhiều loại tác nhân kháng nguyên gây bệnh khác nhau [4].
1.2.4. Các lớp kháng thể
Các kháng thể được phân thành 5 lớp hay isotype. Tùy theo cấu tạo của các
domain hằng định của các chuỗi nặng: các chuỗi nặng , , , và lần lượt tương
ứng với các immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA, IgM, IgE và IgD.Tất cả các
kháng thể đều chứa các chuỗi nhẹ là kappa và lambda
Ngoài ra, các khác biệt đặc trưng hơn cũng tồn tại bên trong một số lớp
Hình 11: Kháng thể đơn dòng, liên kết với một epitope đặc hiệu.
b. Kháng thể đa dòng
Các kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope
khác nhau trên một kháng nguyên cho trước (hình 12). Trong đáp ứng miễn dịch, cơ
18
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên:
đáp ứng như vậy gọi là đa dòng [4].
Hình 12: Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau.
1.2.6. Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng
1.2.6.1.
Chuẩn bị kháng nguyên
Việc chuẩn bị kháng thể đa dòng đòi hỏi phải có kháng nguyên sạch. Còn kháng
thể đơn dòng được sản xuất từ kháng nguyên chưa sạch. Các protein hòa tan lộ ra sự
đáp ứng mạnh có thể biến hóa thành những kháng nguyên đặc thù bởi sự liên kết chúng
với cơ chất rắn. Acid nucleic bình thường không gây ra miễn dịch nhưng khi liên kế
với protein mang nó thì sẽ gây ra miễn dịch. Carbohydrate loại đơn giản thì thường có
tính miễn dịch yếu và cần thiết liên kết với một protein mang nó. Carbohydrate càng
lớn thì có thể gợi ra sự đáp ứng bình thường nhưng không gây ra đáp ứng thứ cấp.
Kháng nguyên có thể được chuẩn bị bằng nhiều cách như: (i) nghiền phá hủy các mô
thiết phải bổ sung tá dược.
b. Con đường gây miên dịch
Phương pháp chung thường là gây miễn dịch cho thỏ hoặc chuột là tiêm dưới da
bởi một lượng lớn có thể tiêm vào động vật và kháng thể đặc hiệu có thể được dẫn qua
bởi phương pháp này. Tiêm tĩnh mạch đã được thử trên thỏ, sự đáp ứng nhanh và mạnh
bởi vì kháng nguyên đi vào máu và nhanh chóng tới các cơ quan sinh miễn dịch như
gan, lách và phổi. Tuy nhiên, tiêm tĩnh mạch không thích hợp lắm cho lần tiêm đầu tiên
vì kháng nguyên đặc hiệu dễ bị loại trừ bởi những chất hóa học thô như azide sodium
đi qua đường phổi.
1.2.6.3.
Sản xuất kháng thể đơn dòng
Huyết thanh chứa một dãy các kháng thể và chúng đặc hiệu với các kháng
nguyên khác nhau. Khi động vật được gây miễn dịch thì khoảng 1/10 kháng thể tuần
hoàn đặc hiệu với kháng nguyên. Các kháng thể được sản xuất bởi tương bào từ tế bào
B được biệt hóa. Mỗi tế bào B bố mẹ có khả năng sản xuất các kháng thể đặc hiệu. Các
20
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
kháng thể được bài tiết bởi dòng tế bào lympho B thì giống hệt nhau và đây cũng là
nguồn gốc của các tế bào đồng nhất. Song các tế bào tương bào có đời sống tương đối
ngắn và cũng không thể lớn lên được trong nuôi cấy.
Năm 1975, Kohler và milstein đã phát triển kỹ thuật cho phép tương bào được
hòa vào các tế bào ung thư Myeloma để tạo ra các tế bào lai và lớn lên. Các tế bào này
Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
một phần cấu trúc giới hạn của kháng nguyên. Phần cấu trúc giới hạn này được gọi là
quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) hay epitope.
Tính kháng nguyên là đặc tính của một epitope có cấu trúc ba chiều của phân tử
kháng nguyên. Phần cấu trúc này của phân tử kháng thể hoặc của thụ nhận diện epitope
kháng nguyên gọi là paratope. Tính miễn dịch của một epitope kháng nguyên là đặc
tính gây ra một đáp ứng miễn dịch của phân tử kháng nguyên khi nó xâm nhập vào cơ
thể. Trong trường hợp kháng nguyên là các protein, người ta có thể nhận biết được kích
thước của một epitope kháng nguyên vào khoảng 5 đến 10 gốc acid amin bằng phương
pháp phân hủy hóa học hoặc phân hủy enzyme đối với kháng nguyên này. Người ta
cũng phân biệt một dạng epitope thứ hai, gọi là epitope gián đoạn. Loại epiotop này
được sắp xếp nhưng lại gần nhau về không gian của protein do sự gấp lại của chuỗi
polypeptid.
Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể có tính đặc hiệu cao, một kháng
nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặc
hiệu với kháng nguyên A.
Nhiều chất hóa học có phân tử lượng nhỏ, phân cực mạnh có khả năng gây ra sự
tổng hợp một kháng thể đặc hiệu sau khi được kết hợp với phân tử mang có kích thước
lớn hơn. Các chất hóa học này được gọi là hapten và được coi là tương đương với
những quyết định kháng nguyên tách rời. Các hapten có khả năng phản ứng với các
kháng thể đặc hiệu của chúng. Tuy nhiên, để gây ra phản ứng miễn dịch in vivo, một
hapten cần phải liên kết với protein mang. Sự kết hợp của hapten và protein mang sẽ
tạo ra một cấu trúc kháng nguyên sinh miễn dịch có ít nhất hai quyết định kháng
nguyên khác nhau.
1.4.
Tá chất
Các tá chất (Adjuvants): Tá chất là một chất hoặc một hỗn hợp các chất có khả
Copyright: Tài liệu đại học ©