Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THÀNH ĐẠT

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG
KHÁNG KHÁNG NGUYÊN ĐẶC HIỆU TRÊN VỎ
BÀO TỬ B. anthracis

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. ĐỖ NGỌC LIÊN

HÀ NỘI

1


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

MỞ ĐẦU

•

Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi
khuẩn Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái
tổ hợp)

•

Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng này với protein đó
trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis.

Đây là bước đầu tiên trên con đường nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ
hợp để sản xuất kháng thể đơn dòng tại Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu Nghiệp vụ
-Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật-Bộ Công An.

3


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi khuẩn B. anthracis
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis
B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi
khuẩn gây bệnh. Vào năm 1877, R. Koch đã nuôi vi khuẩn này dưới dạng
chủng thuần khiết, chứng minh được khả năng hình thành bào t ử của nó v à gây
được bệnh than thực nghiệm bằng cách cấy nó vào cơ thể động vật.


Trong các chương trình về vũ khí sinh học (VKSH) vi khu ẩn gây b ệnh
than B. anthracis được coi là tác nhân sinh học thường đựơc chú ý quan tâm
nhiều nhất vì trực khuẩn than có thể tồn tại trong thiên nhiên d ưới d ạng nha
bào (bào tử) trong thời gian hơn 10 năm, có khả n ăng ch ịu nhi ệt 160 độ C trong
vòng 5 phút, chịu nước sôi đến 10 phút... .
Người bị nhiễm bệnh than qua 3 con đường: qua da, đường tiêu hoá v à
đường thở. Bào tử than khi bị hít thở qua mũi chúng có khả năng vào tới các phế
nang để gây bệnh than thể hô hấp và cư trú ở các ph ế b ào của ph ế nang, qua h ệ
thống mạch bạch huyết chuyển tới hạch lympho của trung thất. Tại đó các vi
khuẩn gây bệnh than này sinh trưởng và xâm nhập theo đường máu gây nhiễm
khuẩn huyết và nhiễm khuẩn nhiều nơi trong cơ thể, gây tỷ lệ tử vong r ất cao
[3].
Độc tố của vi khuẩn than có sự tham gia của 3 yếu tố cấu thành: kháng
nguyên bảo vệ (Protective Antigen-PA), giúp hai cấu tử khác là yếu tố gây phù
nề (Edema Factor -EF) và yếu tố gây chết (Lethal Factor -LF) xâm nh ập được
vào tế bào của vật chủ và gây độc. Về bản chất đây là 3 peptid do bản thân vi
khuẩn sinh ra. Yếu tố gây phù nề làm bất hoạt tế bào bạch cầu trung tính c ủa
vật chủ làm cho các tế bào này không có khả năng thực bào để tiêu diệt vi
khuẩn. Các nhà nghiên cứu cho rằng yếu tố gây ch ết của vi khu ẩn than kích
thích các đại thực bào sản sinh TNF-alpha và interleukin-1-beta (cả hai yếu t ố
này là thành phần của hệ miễn dịch có tác dụng trong ph ản ứng viêm v à s ốc
phản vệ) và yếu tố này có thể gây chết vật chủ. Đây cũng là yếu tố khác biệt chủ
yếu của B. anthracis so với các chủng tương tự như B. cereus…[9,10]

5


Luận văn thạc sỹ


liên kết lỏng lẻo, được xem là nơi tiếp xúc bề mặt giữa bào tử và môi trường [12].
Trong khi ở B. subtilis , lớp áo (coat) là lớp ngoài cùng của bào tử thì ở vi
khuẩn B. anthracis , B. thuringiensis, B. cereus có vỏ bào tử là lớp ngoài cùng. Cả áo
bào tử và vỏ bào tử đều có cấu trúc linh hoạt, khả năng đàn hồi tốt. Mặt khác trên áo và
vỏ bào tử tập trung một số enzyme có tác dụng bảo vệ.

7


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Hình 3: Cấu tạo bào tử quan sát dưới kính hiển vi điện tử [3,5 ]
Ở hình 3a, là cấu tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis , có lớp ngoài cùng là áo
bào tử (Oc: outer coat layer). Ở lớp này tập trung chủ yếu các protein (chiếm khoảng
30% protein bào tử). Ước tính có khoảng 70 protein trên lớp áo bào tử, phần lớn các
protein này là đặc hiệu cho chủng B. subtilis , người ta thường dựa vào các protein đó
để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn này. Khác với vi khuẩn B. subtilis có lớp áo bào tử
dày với lớp bên trong sáng và lớp bên ngoài tối, vi khuẩn than có áo bào tử mỏng. Lớp
này được phân cách với lớp ngoài cùng bởi khoảng giữa (Is: interspace). Đối với các
chủng B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis, B. mycoides và một số thuộc nhóm
Clostridia thì lớp ngoài cùng là vỏ bào tử. Hình 3b và hình 4 mô tả cấu tạo bào tử của
vi khuẩn than.

8


Luận văn thạc sỹ



giống

như các sợi
lông (Hn: hair-like nap). Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử và dùng nhiễu xạ Xquang, người ta thấy lớp cơ bản dày khoảng 190A 0 được hình thành từ các lớp mỏng
hơn. Lớp cơ bản gồm 4 tấm kết tinh, mỗi tấm có cấu trúc lỗ có hình lục giác. Ở B.
cereus và B. anthracis thì lớp cơ bản dày khoảng 20-30nm. [14].
Phần lông bao quanh bên ngoài là một glycoprotein gọi là BclA (Bacillus
collagen-like protein of anthracis). Phần cấu trúc của BclA sẽ được mô tả cụ thể ở phần
sau. Vỏ bào tử chiếm khoảng 2% khối lượng của bào tử và có khoảng 50%

protein, 20% lipid , 20% polysaccharides trung tính, và 10% là các thành phần
khác. Chức năng chính của vỏ bào tử là chống lại các tác nhân môi trường, do bề mặt
kỵ nước nên làm tăng khả năng kết dính của bào tử. Mặt khác trên vỏ bào tử chứa một
số enzyme có chức năng hoạt hoá sự hoạt động của bào tử. Vỏ bào tử cũng chính là

9


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

điểm đầu tiên để bào tử tương tác với tế bào vật chủ của hệ thống miễn dịch [8].
1.1.3. Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than
Các protein trên vỏ bào tử B. anthracis là đối tượng thường được sử dụng để
phát hiện sự có của vi khuẩn than. Theo thống kê của một số tài liệu [14] thì có khoảng
gần 20 protein có mặt trên vỏ bào tử của vi khuẩn này. Có thể kể đến một số protein
sau: BclA, Alanine racemase (Alr), Inosine hydrolase (InH), Protein ExsF, Protein


khuẩn [ 14 ]

11


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Protein nhóm F như BclA, ExsB, ExsC, ExsD,BxpB,... là các protein có trọng
lượng phân tử cao. Có thể kể đến những đặc điểm cơ bản của một số protein thuộc
nhóm này. BxpB được tìm thấy ở lớp cơ bản nhờ đánh dấu miễn dịch huỳnh quang
bằng vàng. Protein này tạo phức liên kết hoá trị mạnh với BclA, các protein khác ở lớp
cơ bản và lớp lông bên ngoài gồm ExsY và CotY. Khi BxpB được tách chiết từ bào tử
bằng SDS, nó được tách ở cả dạng đơn phân và dạng phức hệ khối lượng phân tử lớn
với BclA. BxpB bị đột biến không có khả năng bám với lông bên ngoài, mặc dù BclA
vẫn được tổng hợp bình thường. Thiếu BxpB dẫn đến bào tử nảy mầm nhanh hơn. Một
nhóm các protein, như BxpA, BxpB (còn gọi ExsFA), BxpC, ExsC... chỉ được tìm thấy
ở các vi sinh vật thuộc B. cereus (Bảng 1, nhóm F). Điều này cho thấy vỏ bào tử ở các
sinh vật khác được gắn với lớp cơ bản bằng một nhóm các protein khác. Protein trên vỏ
bào tử của vi khuẩn mang tính đặc hiệu thường được dùng như maker chỉ thị sự có mặt
của vi khuẩn đó [14].
1.1.4. BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định sự có mặt của vi khuẩn
than

Như đã nói ở trên, một trong những thành phần chính của vỏ bào tử là
lớp lông bên ngoài của vỏ bào tử có thành phần chủ yếu là BclA ( Bacillus
collagen-like protein of anthracis). Phần lông và sự liên kết của các sợi lông này

lần đầu tiên được mô tả trong vỏ bào tử của B. anthracis v ào n ăm 1966. BclA có

phần đầu N và đầu C có trình tự đa hình, cho phép phân biệt giữa các loài và các
chủng. Sự khác nhau về số lượng lặp lại cũng tương ứng với độ dài của lông trên vỏ
bào tử. Các đột biến BclA sẽ làm mất khả năng nhìn thấy lông ở ngoài bề mặt vỏ bào
tử. Vùng kết thúc đầu C (CTD: C-terminal domain ) gồm 134 acid amin là yếu tố cần
thiết để hình thành cấu trúc xoắn ba lần (triple) của protein BclA. CTD có thể tạo thành
dạng xoắn gồm 3 phần CTD một cách tự nhiên. Domain này nằm hướng ra phía ngoài
lớp vỏ bào tử và là phần lộ ra ngoài chủ yếu của BclA. [17,19,20]
Hình 7: Cấu trúc 3D
của phân tử BclA
[ 12,16,17 ]
BclA tái tổ hợp kháng
được một số protease
nhưng rất dễ bị tác
động bởi collagenase,

13


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

trong khi đó BclA liên kết đường (glycosylated BclA) tự nhiên có thể kháng lại cả 2
enzyme này. Xử lý BclA tái tổ hợp bằng enzyme collagenase làm phân hủy các acid
amin ở hai đầu của vùng giống collagen nhưng vùng CTD không bị phân hủy.
BclA được dự đoán là có cấu trúc dạng kẹo que (lollipop), phần CTD tạo thành
đầu xoắn của quả cầu protein. Domain CTD có dạng hình cầu và có độ tương đồng cao
với protein bổ thể C1q và yếu tố hoại tử khối u. Cả BclA và bổ thể C1q đã được chứng
minh là có khả năng tương tác với thành phần SP-C (một thành phần chính trên bề mặt
phế nang phổi)


14


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Hình 8: Cấu
trúc

của

Tetrasaccharide [20 ]
Sự lặp lại của
GPT được ổn định bởi
sự glycosyl hoá. BclA tái
tổ hợp được biểu hiện
trong E.coli không bị
glycosyl hoá. BclA hiếm khi không bị glycosyl hoá vì nó gián tiếp liên kết với sản
phẩm của quá trình glycosyl hoá này. Khi các protein có nguồn gốc ở bào tử được xử

trifluoromethanesulfonic (TFMS) nhằm loại bỏ sự glycosyl hoá,
protein vẫn giữ lại một phần đường.
lý với acid

Bản chất quá trình glycosyl hoá tự nhiên của BclA đóng một vài trò quan trọng
trong việc liên kết bào tử với các phân tử carbohydrate của màng các tế bào trình diện
kháng nguyên ở động vật. Điều này cũng có thể bảo vệ vỏ bào tử khỏi sự glycosyl
hoá , tách enzyme ra khỏi bào tử để giúp loại trừ một số phân tử tiếp cận với bào tử.

gồm

hai

chuỗi nặng (H, heavy)
giống nhau và hai chuỗi
nhẹ

(L,

light)

cũng

giống nhau. Có hai loại
chuỗi nhẹ κ (kappa) và
λ (lambda), do đó hai
chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ. Các
chuỗi của immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có độ đàn hồi
nhất định. Một phần cấu trúc của các chuỗi cố định nhưng phần đầu của hai "cánh tay"
chữ Y thì rất biến thiên giữa các kháng thể khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có
khả năng phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng, điều này tương tự như
một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó. Có thể tạm so sánh sự đặc hiệu của phản ứng
kháng thể-kháng nguyên như ổ khóa và chìa khóa [4].
1.2.2. Các domain hằng định

Hình 10: Sơ đồ các chuỗi
của một kháng thể.
Các domain hằng
định (C, constant domain)

nên vị trí nhận diện và liên kết với epitope của kháng nguyên ( ph ần kháng th ể
liên kết với kháng nguyên còn gọi là paratopee). Như vậy, mỗi immunoglobulin
có hai vị trí gắn kháng nguyên. Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một
kháng thể có thể gắn được với 2 kháng nguyên giống nhau. Hai "cánh tay" của
chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần liên kết kháng nguyên, F: fragment, ab:
antigen binding). Domain của kháng nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope
Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều và biểu
hiện đa dạng giữa các kháng thể. Chính sự biến thiên đa dạng này giúp cho h ệ
thống các kháng thể nhận biết được nhiều loại tác nhân kháng nguyên gây b ệnh
khác nhau [4].
1.2.4. Các lớp kháng thể

Các kháng thể được phân thành 5 lớp hay isotype. Tùy theo cấu tạo của
các domain hằng định của các chuỗi nặng: các chuỗi nặng γ, α, µ, ε và δ lần lượt
tương ứng với các immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA, IgM, IgE v à
IgD.Tất cả các kháng thể đều chứa các chuỗi nhẹ là kappa và lambda
Ngoài ra, các khác biệt đặc trưng hơn cũng tồn tại bên trong m ột s ố l ớp
immunoglobulin. Ởngười, có 4 loại dưới lớp (subclass) IgG (IgG1, IgG2, IgG3 v à
IgG4) và 2 loại dưới lớp IgA (IgA1 và IgA2).
Thông thường một tế bào B sản xuất đồng thời nhiều lớp kháng thể: chúng
khác nhau ở phần C các chuỗi nặng nhưng giống hệt nhau ở tính đặc hiệu với
một kháng nguyên.
Mỗi lympho B chỉ có thể sản xuất 1 loại kháng th ể đặc hi ệu đối v ới 1
epitope kháng nguyên nhất định, do đó cần phải có hàng nhiều triệu lympho B
khác nhau. Số lượng này vượt quá số lượng gen của con người.
Trong đó, IgG là loại immunoglobulin monomer, là kháng th ể ph ổ bi ến
nhất trong máu và các dịch mô. Đây là isotype duy nh ất có th ể xuyên qua m àng
nhau thai, qua đó bảo vệ trẻ sơ sinh trong những tuần l ễ đầu đời sau khi sinh khi

18

nhau

trên

một

kháng nguyên cho trước (hình 12). Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể
tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên: đáp ứng như vậy gọi là đa dòng [4].

19


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Hình 12:
Các kháng
thể đa
dòng, mỗi
kháng thể
liên kết với
một epitope
khác nhau.
1.2.6. Phư
ơng
pháp
tạo

kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng

nguyê) vào sinh vật và sau một thời gian thích hợp thì sẽ tách huyết thanh tương ứng.
Sự đáp ứng miễn dịch sẽ phụ thuộc vào lượng và bản chất kháng nguyên cũng như khả
năng đáp ứng miễn dịch của vật được tiêm với kháng nguyên đó. Thông thường, trong
lần tiêm đầu tiên thì kháng thể sinh ra chứa IgM với nồng độ rất thấp, lần tiêm thứ hai
thì nồng độ kháng thể IgG đạt ở mức trung bình. Tuy nhiên, trong những lần kế tiếp sẽ
làm tăng nồng độ của kháng thể IgG đáng kể.
a. Chuẩn bị hỗn hợp tá dược kháng nguyên
Kháng nguyên được trộn với tá dược trước khi tiêm với mục đích là làm cho kháng
nguyên giải phóng từ từ để kích thích hệ thống sinh miễn dịch của sinh vật. Để chuẩn
bị tá dược kháng nguyên thì thường trộn dung dịch kháng nguyên với tá dược Freund
tương đương với nhau. Ngoài tá dược Freund thì cũng có thể dùng một số khác như
Titermax với liều 50-500ml/động vật. Tuy nhiên, với những tế bào sống thì không cần
thiết phải bổ sung tá dược.
b. Con đường gây miên dịch
Phương pháp chung thường là gây miễn dịch cho thỏ hoặc chuột là tiêm dưới da
bởi một lượng lớn có thể tiêm vào động vật và kháng thể đặc hiệu có thể được dẫn qua
bởi phương pháp này. Tiêm tĩnh mạch đã được thử trên thỏ, sự đáp ứng nhanh và mạnh
bởi vì kháng nguyên đi vào máu và nhanh chóng tới các cơ quan sinh miễn dịch như
gan, lách và phổi. Tuy nhiên, tiêm tĩnh mạch không thích hợp lắm cho lần tiêm đầu
tiên vì kháng nguyên đặc hiệu dễ bị loại trừ bởi những chất hóa học thô như azide
sodium đi qua đường phổi.
1.2.6.3.

Sản xuất kháng thể đơn dòng

Huyết thanh chứa một dãy các kháng thể và chúng đặc hiệu với các kháng
nguyên khác nhau. Khi động vật được gây miễn dịch thì khoảng 1/10 kháng thể tuần

21


nguyên nhờ thụ thể đặc hiệu. Sự nhận biết gây cảm ứng sinh sản lympho-B và biệt hóa
quần thể tế bào này thành các tế bào plasma có khả năng sản xuất kháng thể chống lại
kháng nguyên xâm nhập. Đó là đáp ứng miễn dịch thể dịch. Đáp ứng miễn dịch cũng
có thể gây ra sự xuất hiện quần thể lympho-T miễn dịch mang các thụ thể đặc hiệu với
kháng nguyên. Đó là sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào.

22


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Tính phản ứng của kháng nguyên hoặc khả năng nhận biết, khả năng liên kết
đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể hoặc với thụ thể của tế bào phụ thuộc vào
một phần cấu trúc giới hạn của kháng nguyên. Phần cấu trúc giới hạn này được gọi là
quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) hay epitope.
Tính kháng nguyên là đặc tính của một epitope có cấu trúc ba chiều của phân tử
kháng nguyên. Phần cấu trúc này của phân tử kháng thể hoặc của thụ nhận diện epitope
kháng nguyên gọi là paratope. Tính miễn dịch của một epitope kháng nguyên là đặc
tính gây ra một đáp ứng miễn dịch của phân tử kháng nguyên khi nó xâm nhập vào cơ
thể. Trong trường hợp kháng nguyên là các protein, người ta có thể nhận biết được kích
thước của một epitope kháng nguyên vào khoảng 5 đến 10 gốc acid amin bằng phương
pháp phân hủy hóa học hoặc phân hủy enzyme đối với kháng nguyên này. Người ta
cũng phân biệt một dạng epitope thứ hai, gọi là epitope gián đoạn. Loại epiotop này
được sắp xếp nhưng lại gần nhau về không gian của protein do sự gấp lại của chuỗi
polypeptid.
Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể có tính đặc hiệu cao, một kháng
nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặc
hiệu với kháng nguyên A.

+ Tăng cường khả năng chế biến và trình diện kháng nguyên của tế bào APC.
+ Thúc đẩy tế bào B sinh kháng thể và làm tăng ái lực của kháng thể.
+ Kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tăng sinh tế bào lympho.

24


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1. Nguyên liệu
- Chuột chủng dòng Swiss Mus musculus, được mua ở Viện Vệ sinh dịch tễ TW.
- Chủng vi khuẩn B. anthracis (Viện vệ sinh phòng dịch Quân đội)
- Cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP. (Hãng GE Healthcare)
- Đĩa ELISA 96 giếng
- Các vật tự tiêu hao khác như đầu côn, fan col, ống nhựa ....
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
- Bộ điện di (Bio-Rad-Mỹ)
- Máy li tâm lạnh (Solval-Mỹ).
- Tủ lạnh (Nhật)
- Tủ hút hoá chất (Đức)
- Máy khuấy từ (Ika-Hàn Quốc)
- Hệ thống tinh chế protein (Bio-Rad-Mỹ)
- Máy định lượng DNA, protein (GeneQuant-Pro-Anh)