1
Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và
nghiên cứu điều kiện tối ưu để
nhuộm tế bào phục vụ chẩn
đoán bệnh ung thư bạch cầu
Trần Văn Tính
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận án TS ngành: Hóa học hữu cơ; Mã số: 62 44 27 01
Người hướng dẫn: PGS.TSKH. Lưu Văn Bôi, GS.TS.
Nguyễn Anh Trí
Năm bảo vệ: 2012
Abstract: Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-
thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều
chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu
người. Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất
nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người. Xác định
cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng các
phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H-
NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa
độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc
phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng
tử. Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm
esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ
chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Nghiên cứu
Một là, cho đến nay việc tổng hợp nguyên liệu đầu vẫn
thực hiện theo phương pháp truyền thống nên hiệu suất
3
thấp; thứ hai, kết quả nhuộm chênh lệch so với phương
pháp di truyền và miễn dịch còn cao (~29%); thứ ba, là cơ
chất dễ phân hủy khi nhiệt độ >-20
0
C, khó khăn trong vận
chuyển và bảo quản. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng phương
pháp tiên tiến để tổng hợp cơ chất mới có hoạt tính cao và
giá thành rẻ hơn nhằm sản xuất kít nhuộm esteraza tế bào
bạch cầu ở Việt Nam, phục vụ việc khám và chữa bệnh cho
cộng đồng là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh
tế - xã hội cấp thiết.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là ứng dụng phương
pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp cơ chất; khảo sát một
cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để
tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn;
tối ưu hóa các điều kiện nhuộm nhằm giảm sự chênh lệch
và chế tạo bộ kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục
vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án
1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm
esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người.
2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất
nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người.
cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat có hoạt tính với
esteraza đặc hiệu bạch cầu người.
- Đã nghiên cứu một cách có hệ thống và xác định được ảnh
hưởng của hiệu ứng electron các nhóm thế X, yếu tố không
gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và của các
gốc cacboxylat lên hoạt tính nhuộm esteraza đặc hiệu bạch
cầu người.
- Đã khảo sát có hệ thống phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu
bạch cầu người bằng các hợp chất 3-(N-thế)naphtalen-2-yl-
cacboxylat và đã xác định được cơ chất mới có độ nhạy
cao hơn cơ chất naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma
5
bán trên thị trường.
- Đã tiến hành nghiên cứu kế hoạch hóa thực nghiệm theo
phương pháp đơn hình và tìm được điều kiện tối ưu sản
xuất kít nhuộm esteraza để phân loại dòng tế bào bệnh
bạch cầu cấp.
5. Điểm mới của luận án
- Đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật mới hiệu quả cao là
phương pháp lò vi sóng để tổng hợp 16 3-hiđroxi-(N-
thế)naphtalen-2-cacboxamit, trong đó có 3 chất mới.
- Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa các 3-
hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với cacboxylic
cloanhiđrit. Kết quả đã tổng hợp được 38 dẫn xuất 3-(N-
thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat, trong đó có 36
nhập ngoại.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 135 trang, trong đó có 21 hình vẽ, đồ thị,
41 bảng biểu, chưa kể 129 trang phụ lục và 115 tài liệu
tham khảo. Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận án chia
làm ba chương; chương I – Tổng quan tài liệu, gồm 24
trang; chương II – Thực nghiệm, gồm 22 trang và chương
III – Kết quả và bàn luận, gồm 76 trang, Kết luận và kiến
nghị 2 trang.
Liên quan đến nội dung luận án đã đăng 1 bài trên Tạp
chí Thông tin y dược, 3 bài báo trên Tạp chí hóa học (Viện
KH&CN Việt Nam), 1 bài trên Tạp chí Khoa học (ĐHQG
Hà Nội) và đã đăng ký 1 bằng sáng chế (Cục sở hữu trí tuệ
Bộ KH&CN).
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hóa học các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-
cacboxamit
Đã tổng kết các kết quả đạt được trong việc điều
chế, nghiên cứu tính chất và ứng dụng của các hợp chất 3-
hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có cấu trúc như
sau:
7
2
3
1
4
6
5
7
PCl
3
/SOCl
2
OH
O
NH
b) Phương pháp gián tiếp hai giai đoạn
COOH
OH
+ SOCl
2
COCl
OH
- SO
2
COCl
OH
+
NH
2
X
CONH
OH
X
1)
2)
3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit điều chế theo các
NN
X
2
X
3
NH
O
X
b) Làm cơ chất nhuộm hóa học tế bào.
Chương 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên
cứu.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong
luận án
- Phương pháp tổng hợp hữu cơ truyền thống;
- Phương pháp tổng hợp hữu cơ sử dụng lò vi sóng;
- Phương pháp Vật lý và Hóa lý xác định cấu trúc;
- Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm và thống
kê xử lý số liệu;
- Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào và
phương pháp FAB phân loại dòng tế bào;
- Phương pháp tính toán Hóa lượng tử Gaussian
2003 khảo sát mối tương quan định lượng giữa hoạt tính và
cấu trúc.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
9
Mục tiêu đề ra của luận án được thực hiện bắt đầu từ
việc nghiên cứu phương pháp tổng hợp các chất 3-hiđroxi-
0
C và có dung môi
clobenzen ở 135
0
C, thời gian đến 2h. Phản ứng xảy ra theo
sơ đồ sau:
COOH
OH
NH
2
X
C
O
NH
OH
+
PCl
3
, T
0
C
X
Ia-l
h = 40-70%10
X = o-CH
3
(Ia), p-CH
X
Clobenzen
C
O
NH
OH
I a-l
Microwave
PCl
3
,
+
Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tác nhân, thời gian,
nhiệt độ, bản chất dung môi và chế độ làm việc của lò vi
sóng lên hiệu suất sản phẩm Ia-l cho thấy, điều kiện thích
hợp là: tỷ lệ mol axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : dẫn xuất anilin
: PCl
3
= 1 : 1 : 0,3; thời gian 20 phút, nhiệt độ 130
0
C; dung
môi clobenzen; công suất lò 200w. Trong những điều kiện
đó, hiệu suất naphtol AS-X Ia-l đạt 80 - 90%.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý và các dữ kiện
phổ được đưa ra trong bảng 3.4 và 3.5 (xem toàn văn luận
án).
Trên phổ IR của các naphtol AS-X Ia-l có các cực đại
hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị các nhóm hiđroxyl-
νOH ở khoảng 3482 đến 3172 (liên kết hiđro) cm
3.1.3.1. Tổng hợp bằng phương pháp trực tiếp sử dụng
SOCl
2
Để khảo sát ảnh hưởng của tác nhân, đã tiến hành
phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với SOCl
2,
tỷ lệ
mol 1 : 20 ở nhiệt độ phòng trong môi axetonitrin, tiếp theo
cho hỗn hợp tác dụng với dẫn xuất amin (từ 1-1,1 đương
lượng mol so với axit naphtoic). Quá trình phản ứng được
mô tả trên sơ đồ sau:
[CH
3
CN]
COOH
OH
1) SOCl
2
, 2) R
1
NH
2
CONHR
1
OH
1
2
3
45
8'
1'
2'
3'
4'5'
6'
7'
8'
9' 10'
(IIa) (IIb) (IIc)
(IId)12
Sau khi cất loại dung môi, trung hòa bằng NaOH rồi kết
tủa naphtol AS bằng dung dịch HCl, hiệu suất 3-hiđroxi-N-
(xiclohexyl/-phenyl/naphtyl/antraxyl)naphtalen-2-
cacboxamit (IIa-d) đạt gần 20%.
Để cải thiện hiệu suất, đã thực hiện phản ứng theo thứ tự
khác, hòa tan axit 3-hiđroxi-2-naphtoic và amin trong
axetonitrin, sau đó nhỏ giọt SOCl
2
và khuấy hỗn hợp phản
ứng trong thời gian khoảng 2h. Sau khi xử lý, thu được các
sản phẩm IIa-d với hiệu suất như trước.
3.1.3.2. Tổng hợp các hợp chất IIa-d bằng phương pháp
gián tiếp
Đã thực hiện phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic,
amin và SOCl
2
CONHR
1
OH
R
1
NH
2
.HCl
1
2
3
4
5
6
7
8
IIa-d
Sau khi xử lý, hiệu suất 3-hiđroxi-N-
(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit
13
(IIa-d) chỉ đạt tối đa 32%, thấp hơn mong đợi. Nguyên nhân
hiệu suất thấp có lẽ do một phần amin bị kết tủa dưới dạng
muối amoni hiđroclorua.
3.1.3.3. Tổng hợp IIa-d bằng phương pháp trực tiếp sử
dụng PCl
3
Đun hồi lưu hỗn hợp axit 3-hiđroxi-2-naphtoic, amin và
CONHR
1
OH
Microwave
IIa-d
1
2
3
4
5
6
7
8
Kết quả tổng hợp được đưa ra trên bảng 3.7 cho
thấy, trừ trường hợp tác nhân là aniline, tạo sản phẩm IIb
có hiệu suất tương tự như naphtol AS-X, còn
COOH
OH
1) PCl
3
, 2) R
1
NH
2
CONHR
1
OH
1
2
.
15
Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và
1
H-NMR của
các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
2
3
1
4
6
5
7
8
OH
CONHRX
10
9
R=C
6
H
4
(dãy ); C
6
H
10
/C
6
H
X
Hiê
̣
u
suất,
%
Tnc,
0
C
IR (υ, cm
-1
, KBr)
1
H-NMR
(DMSO-d6; δ,
ppm; J, Hz)
OH
NH
CO
amit
OH
NH
OH
NH
CO
amit
OH
NH
Ia
o-
80
227-
3406,
3294
1623
11,39
10,53
Ik
o-
80
174-
3482
3374
1615
12,11;
11,50;
Ia-l
IIa-l
16
CH
3
229
3048
COOCH
3
176
s
Id
p-Cl
83
254-
256
3422,
3054
3291
1636,
1619
11,19
10,66
Chất
R
Hiê
̣
u
suất,
%
Tnc,
0
C
IR (υ, cm
-1
, KBr)
1
H-NMR
(DMSO-d6; δ,
ppm; J, Hz)
Ie
6
H
11
47
160-
162
3441
1623
1604
12,10;
s
8,78;
d;
3
J=8,5
Ig
o-
NO
2
73
193-
195
3420,
3059
3328
1661
12,00
11,04
11,02
IIc
C
10
H
7
67
214-
215
3458
3245
1648
11,93;
s
11,11;
s
Ii
o-
OCH
3
82
161-
162
3197
3197
1640,
1625
tử cường độ 35-45%. Trên hình 3.7 là phổ MS của hợp chất
IId lần đầu tiên tổng hợp được, pic ion phân tử có cường
độ [M+H]
+
(35%). Hình 3.7. Phổ MS của hợp chất IId
3.2. Tổng hợp các 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-
clocacboxylat làm cơ chất nhuộm tế bào bạch cầu
Đã tiến hành điều chế các este 3-(N-thế-
cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clo-cacboxylat bằng phương pháp
tương tự mô tả trong tài liệu của Burtone [16] (xem luận án):
Hòa tan nguyên liệu đầu cacboxamit Ia-l hoặc IIa-d và NH
O
OH
NH
O
OH
NH
O
Để thu được các este 3-(N-thế-cacbamoyl)-naphtalen-2-yl-2-
clo-cacboxylat, đã cải tiến quy trình thí nghiệm, bằng cách
thực hiện phản ứng theo hai giai đoạn. Giai đoạn 1, cho
nguyên liệu đầu Ia-l hoặc IIa-d tác dụng với NaOH, điều
chỉnh pH = 8. Giai đoạn 2, cho clocacboxyl clorua tác dụng
với muối naphtolat tạo thành trong giai đoạn 1. Toàn bộ
quá trình phản ứng được mô tả trên sơ đồ sau:
IIIa-l ;
IVa-l ; Va-g ; VIa-f
CONHR
1
OH
CONHR
1
ONa
2
NaOH 5N
THF
1)
CONHR
1
ONa
2)
RCOCl
THF
5
6
7
8 1
2
2
(IIIg), p-NO
2
(IIIh), o-OCH
3
(IIIi),
p-OCH
3
(IIIj), o-COOCH
3
(IIIk), p-COOCH
3
(IIIl)
2) Naphtol AS-X α-clopropionat: R = CH
3
CHCl; R
1
= X-
C
6
H
4
;
X = o-CH
3
(IVa), p-CH
3
(IVb), o-Cl (IVc), p-Cl (IVd),
o-Br (IVe), p-Br (IVf), o-NO
).
R= CH3CHCl; R1 = Xiclohexyl (
Ve
), phenyl (
Vf
), naphtyl (
Vg
),
antraxyl (
Vh
).
4)
-
Naphtol AS-D và naphtol AS-OL butyrat,
-clobutyrat,
-
clophenylaxetat:
R
1
=o-toluidin; R=CH
2
Cl (
VIa
), CHClCH
3
(
VIb
22
Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và
1
H-NMR của các naphtol AS-X cacboxylat
3
2
4
1
7
8
6
5
OCOCHClR
CONH
1'
5'
2'
6'
X
10
3'
4'
9
12
R=H (dãy IIIa-l), CH
3
(dãy IVa-l)
X
Chất
NH
CO
este
CO
amit
NH
H-
12
NH
CO
este
CO
amit
NH
H-12
o-CH
3
IIIa
55
173-
175
3323
1770
1658
10,45
4,66
IVa
52
131-
q;
3
J=7,0
23
o-Cl
IIIc
51
128-
130
3232
1769
1650
10,68
4,65
IVc
52
132-
134
3343
1776
1684
10,22
5,0;
q;
3
J=7,0
p-Cl
IIId
54
53
120-
123
3226
1779
1627
10,21
5,02;
q;
3
J=7,0
p-Br
IIIf
48
188-
190
3281
1769
1621
10,70
4,65
IVf
53
160-
162
3384
1774
1667
10,68
5,01;
2
IIIh
54
179-
181
3384
1774
1667
11,16
4,67
IVh
54
157-
159
3354
1759
1688
11,16
5,01;
q;
3
J=7,0
o-OCH
3
IIIi
53
132-
134
51
139-
141
3337
1764
1651
10,39
5,0;
q;
3
J=7,0
o-
COOCH
3
IIIk
51
186-
188
3327
1764
1718
11,35
4,69
IVk
42
121-
122
3286
1766
t;
3
J=7,0
Copyright: Tài liệu đại học ©