BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THANH ĐÀO

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH AZOSPIRILLUM SP.
VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG TRÊN VÀI DẠNG
CÂY TRỒNG NGẮN NGÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Nguyễn Thanh Đào MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viếr tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Danh mục các đồ thò
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm 4
1.1.1 Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây
trồng 4
1.1.1.1 Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây 4
1.1.1.2 Vai trò của đạm đối với đời sống cây trồng 4
1.1.2 Tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm 7
1.1.2.1 Cố đònh đạm hóa học 7
1.1.2.2 Cố đònh đạm sinh học 9
1.2 Vi sinh vật cố đònh đạm và cơ chế của quá trình cố đònh đạm sinh
học 10
1.2.1 Các loài vi sinh vật cố đònh đạm 10
1.2.1.1 Vi khuẩn cố đònh nitơ sống tự do 10
1.2.1.2 Vi khuẩn cố đònh nitơ cộng sinh 10
1.2.1.3 Vi khuẩn cố đònh nitơ sống trên rễ hay trong rễ một
số loài cỏ nhiệt đới 11
Chương 2 - VẬT LIỆU-NỘI DUNG-PHƯƠNG PHÁP 34
2.1 Vật liệu 35 2.1.1 Thiết bò và dụng cụ 35
2.1.2 Hóa chất và môi trường 35
2.1.3 Vật liệu thí nghiệm 39
2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 40
2.2.1 Phân lập 40
2.2.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và
sinh IAA tốt 41
2.2.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng
được chọn 43
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn 46
2.2.4.1 Chuẩn bò 46
2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn trên
cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây
lúa ngoài ruộng 47
2.2.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 52
2.2.5.1 Chuẩn bò 52
2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên
cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 54
Chương 3 – KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 57
3.1 Phân lập 58
3.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và sinh
IAA tốt 61
3.2.1 Khả năng cố đònh đạm của 5 chủng A
1
, A
2

3.4.1 Thời gian thích hợp nhiễm dòch nuôi cấy vi khuẩn đạt hiệu
quả 69
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ
trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng 71
3.4.2.1. Cây mạ trong ống nghiệm 71
3.4.2.2. Cây lúa trong chậu 76
3.4.2.3. Cây lúa ngoài ruộng 78
3.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 88
3.5.1 Chuẩn bò 88
3.5.1.1. Dòch nuôi cấy vi khuẩn 88
3.5.1.2. Chế phẩm “phân vi sinh” 95
3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây
lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 97
3.5.2.1 Lúa trong chậu 97
3.5.2.2 Cải thìa 99
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 106
TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng trên môi trường NFb rắn có
bổ sung congo đỏ sau 5 ngày nuôi cấy 60
Bảng 3.2. Hàm lượng đạm của 5 chủng trong môi trường Dobereiner dòch
thể 61
Bảng 3.3. Hàm lượng IAA trong dòch nuôi cấy (μg/ ml) theo thời gian 64
Bảng 3.4. Chiều cao trung bình cây lúa (mm) sau 7 ngày theo thời gian
ngâm hạt 70
Bảng 3.5. Giá trò trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong

theo thời gian 88
Bảng 3.14. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A
3
theo thời gian 89
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa
vào giá trò OD
610nm
91 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa vào
giá trò OD
610nm
93
Bảng 3.17. Mật độ tế bào A
2
và A
3
trong 1

gram chế phẩm theo thời
gian với sự thay đổi độ ẩm 95


Trang
Hình 3.1. Phân lập Azospirillum từ đất vùng rễ lúa 58
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của các chủng sau 5 ngày nuôi cấy trên
môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ 59
Hình 3.3. Đònh tính IAA của các chủng thông qua thuốc thử Salkowski 62
Hình 3.4. Phản ứng màu IAA với thuốc thử Salkowski của các chủng
nuôi cấy 5 ngày 65
Hình 3.5. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dòch thể - NFb
của chủng A
2
và

A
3
67
Hình 3.6. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dòch thể
Andrade của chủng A
2
và

A
3
68
Hình 3.7. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn (cây mạ 7 ngày tuổi trên môi
trường MS) 72
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3

3
……………………………… 79
Đồ thò 3.5. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn đến khả năng phân nhánh của
cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của
chủng A
2
và A
3………
82
Đồ thò 3.6. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A
2
theo thời gian 89
Đồ thò 3.7. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A
3
theo thời gian 90
Đồ thò 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa
vào giá trò OD
610nm
91
Đồ thò 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa vào
giá trò OD
610nm

MT5 : Môi trường nuôi cấy thử khả năng khử nitrate
MT6 : Môi trường MS
MS : Murashige & Skoog
N : Đạm
NFb : nitrogen-fixing broth
OD (Optical Density) : Mật độ quang
PL : Phân loại a, b, c, … trong xử lý thống kê
TN : Thí nghiệm

1

MỞ ĐẦU

Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi cung cấp gạo lớn nhất nước, góp phần
xuất khẩu gạo ra thế giới. Thế nhưng hàng năm lũ lụt kéo về đã gây thiệt hại về
người cũng như mùa màng. Nhằm chăm lo đời sống cho người dân vùng lũ đồng
thời vẫn đáp ứng đủ gạo cho nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu, chính quyền khu
vực chỉ đạo bao đê một số vùng ngập lũ. An Giang cũng không thuộc ngoại lệ.
Từ đó, đất không còn độ màu mỡ do phù sa mang lại. Chính vì vậy, để đáp ứng
nhu cầu dinh dưỡng cho cây trồng, đất phải thường xuyên được bón phân.
Việc sử dụng phân bón hóa học liên tục làm cho đất bò bạc màu và chua,
vai trò của vi sinh vật đất giảm, chất lượng nông sản kém thậm chí gây ô nhiễm
môi trường. Trong khi đó, phân vi sinh vật là loại sản phẩm chứa một hoặc nhiều
chủng vi sinh vật sống, có ích đã được tuyển chọn mà hoạt động của chúng tạo
nên trong đất trồng các chất dinh dưỡng hay các chất có hoạt tính kích thích sinh
trưởng, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng nông sản, tăng độ màu
mỡ cho đất. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, vật nuôi,
môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. Hiện nay người ta đã nghiên cứu sản
xuất phân vi sinh vật bao gồm phân bón vi sinh vật cố đònh đạm, phân bón vi sinh
phân giải các hợp chất phospho khó tan, phân bón vi sinh vật phân giải cellulose,

3

CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN

TAØI LIEÄU
4

1.1. Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm
1.1.1. Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây trồng
1.1.1.1. Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây
Tỷ lệ đạm trong cây biểu hiện từ 1 - 6% trọng lượng chất khô. Tỷ lệ đạm
trong bộ phận non cao hơn bộ phận già. Trong thời kỳ hình thành quả, đạm tập

truyền, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein.
Do vậy đạm là yếu tố cơ bản của quá trình đồng hóa carbon, kích thích sự
phát triển của bộ rễ và kích thích việc hút các yếu tố dinh dưỡng khác.

5

Cây trồng được bón đủ đạm biểu hiện ở lá có màu xanh thẫm, sinh trưởng
khỏe mạnh, chồi búp phát triển nhanh, năng suất cao.
Bón thừa đạm, lá có màu xanh tối, thân mềm, tỷ lệ nước cao nên dễ bò sâu
bệnh. Tình hình lốp đổ của các giống lúa thân dài cũng là hậu quả của việc bón
thừa đạm. Ngoài ra, bón thừa đạm sinh trưởng của cây bò kéo dài, chín muộn,
chất lượng nông sản kém, nitrate bò kéo xuống làm ô nhiễm mạch nước ngầm.
Cây thiếu đạm, lá có màu vàng, sinh trưởng và phát triển kém, còi cọc có
khi bò thui chột thậm chí rút ngắn chu kỳ sống, năng suất thấp.
y Tác dụng của đạm đối với cây lúa [10]
Đạm là yếu tố dinh dưỡng chủ yếu, nó có ảnh hưởng nhiều đến thu hoạch
vì chỉ khi đủ đạm các chất khác mới phát huy tác dụng. Đạm kết hợp với các chất
đường, bột ở lá tạo ra amino acid rồi từ đó hình thành nên các loại protein cần
thiết cho đời sống cây lúa. Đạm là một thành phần cấu tạo của chất diệp lục thúc
đẩy quá trình quang hợp. Nếu thiếu đạm, trong cây sẽ có nhiều đạm tự do, cây
lúa sẽ có sức sống yếu dễ bò sâu bệnh phá hại.
Cây lúa hút đạm ở hai dạng : amôn (NH
4
+
) và nitrate (NO
3
-
). Trong ruộng
ngập nước lúa hút amôn nhiều hơn, còn trong ruộng cạn nước lúa hút nitrate
nhiều hơn.

, dẫn đến sự phóng
thích H
+
từ rễ và sẽ tạo acid hóa môi trường bên ngoài. Ngược lại, đối với dưỡng
chất NO
3
-
, khi cây trồng hút NH
4
+
trội hơn sẽ làm cho môi trường kiềm hơn.
Nhiều nghiên cứu cho thấy cây trồng hấp thu NH
4
+
nhanh hơn NO
3
-
trong
giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, trong khi cây hấp thu NO
3
-
nhiều hơn NH
4
+
khi
cây ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Khi NH
3
tự do tích lũy trong cây với lượng
lớn sẽ gây ngộ độc cho cây nên khi được hút vào thường bò đồng hóa ngay bằng
nhiều cách.

OH NH
3

Nitrate có thể bò khử hoàn toàn ở rễ thành dạng amôn, là dạng đạm tham
gia trực tiếp trong quá trình tạo amino acid. Nếu bón nhiều đạm mà thiếu lân hay
không bón lân, kali cân đối, đặc biệt là thiếu nguyên tố vi lượng Mo thì quá trình
khử nitrate sẽ bò chậm lại và dẫn đến tình trạng tồn dư nitrate trong cây. Lượng
nitrate tồn dư trong cây còn do bón cho cây cận ngày thu hoạch làm hàm lượng
nitrate không đủ thời gian để khử thành amôn, tạo thành amino acid và protid có
ích cho cây.
1.1.2. Tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm
1.1.2.1. Cố đònh đạm hóa học
Trong không khí, phân tử nitơ thường tồn tại ở trạng thái liên kết hai
nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ nối ba bền vững (N≡N). Năng lượng cần cho sự
phá vỡ liên kết này khoảng 225kcal nên cây trồng (cũng như các loài động vật)
không có khả năng đồng hóa nguồn nitơ này. Vì vậy việc nghiên cứu phá vỡ các
liên kết này để tạo ra dạng nitơ dễ hấp thu đối với cây xanh là hết sức cần thiết
[3].

8

Năm 1905 lần đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ và liên kết
với
CaC
2
để tạo ra một dạng phân đạm hóa học đầu tiên là CaCN
2
.
Muốn thực hiện phản ứng người ta duy trì một nhiệt độ cao từ 1000 –
1100

khi đó phân kali chỉ tăng 8,4 lần, phân phospho tăng có 5,8 lần [3].
Dù sao thì phân đạm hóa học trên toàn thế giới cũng bù đắp được một
phần nhỏ số lượng đạm trong đất bò lấy đi hàng năm. Có một thống kê cho biết
hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 -
110 triệu tấn đạm, con số này vượt đến bảy lần so với phân đạm hóa học sản
xuất ra ở các nước gộp lại hàng năm. Phân đạm có tác dụng rất lớn đến mùa
màng, ví dụ : bón 1kg đạm thu hoạch thêm được khoảng 10 -20kg thóc, 15 - 20kg
ngô hoặc 15 - 40kg cỏ khô (G.Colarva P.Greenland, 1963).
1000
o
C
CaC
2
+ N
2
CaCN
2
+ C
H
2
O

N
2
+ O
2

4000
o
C

phân tử và chức năng sinh lý chung. Trung tâm của cả hệ thống này là vi khuẩn
Procaryote cố đònh đạm chứa phức hợp enzyme nitrogenase (đảm nhiệm sự
chuyển hóa N
2
thành NH
3
) . Chỉ vài loài Procaryote xác đònh mới có khả năng cố
đònh đạm. Thực vật (ngoại trừ các loại tảo và các thực vật cộng sinh) không có
khả năng cố đònh đạm mà chỉ có những loài Procaryote sống chung với thực vật
mới có khả năng cố đònh đạm.
Quá trình cố đònh đạm sinh học hàng năm cung cấp cho đất từ 100 - 180
triệu tấn đạm và đóng góp 65% lượng nitơ được sử dụng trong nông nghiệp

10

(Burris và Robert, 1993). Phần lớn lượng nitơ này được tạo ra qua quá trình cố
đònh đạm cộng sinh, không cộng sinh và cố đònh đạm kết hợp.
1.2. Vi sinh vật cố đònh đạm và cơ chế của quá trình cố đònh đạm sinh học
1.2.1. Các loài vi sinh vật cố đònh đạm [3]
1.2.1.1. Vi khuẩn cố đònh nitơ sống tự do
Từ năm 1893 Winogradski đã phân lập được vi khuẩn kò khí cố đònh nitơ
Clostridium pasteurianum và tiếp đó năm 1901 Beijerink phân lập được 2 loài vi
khuẩn hiếu khí cố đònh nitơ là Azotobacter chroococum và A. agilis.
Cho đến nay người ta đã phát hiện được rất nhiều loài vi khuẩn cố đònh
nitơ sống tự do. Chúng có thể là hiếu khí (Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia,
Derxia), kò khí không bắt buộc (Aerobacter, Klebsiella, Bacillus polymyxa, B.
macerrans), kò khí bắt buộc (nhiều loài Clostridium, Desulphovibri,
Dsulphotomaculum ).
Một số loài vi khuẩn lam (như Aulosia fertilissima, Tolipothrix tenuis,
Nostoc sp.) cũng có khả năng cố đònh nitơ.

Azospirillum cộng sinh với cỏ Pangola cố đònh hàng năm từ 5 - 30kg đạm/ha. Các
vi sinh vật sống tự do trong đất (Azotobacter, Clostridium, Bluegreenalgae ) cũng
cung cấp hàng năm cho mỗi hecta đất khoảng 5 - 20kg đạm. Gặp điều kiện thuận
lợi tảo lam có thể cung cấp mỗi hecta đến 50kg đạm [19].
1.2.2. Cơ chế của quá trình cố đònh đạm
Cơ chế của quá trình cố đònh đạm được Winogradski và về sau được nhiều
tác giả nghiên cứu, nhưng cho tới nay vẫn còn có chỗ chưa giải quyết được hoàn
toàn. Cái khó nhất lúc đầu gặp phải là phân tử nitơ có sức “trơ” rất cao, lực “ì”
của nó là do hai nguyên tử nitơ (N≡N) được liên kết với nhau bằng 3 mối liên kết
bền vững. Trong công nghiệp phân đạm muốn phá vỡ các liên kết này để tạo ra

12

các dạng đạm cho cây hấp thu được cần phải dùng nhiệt độ cao, áp suất cao.
Theo tính toán, muốn tổng hợp ra một tấn NH
3
từ N
2
và H
2
cần năng lượng tương
đương với năng lượng sinh ra do đốt cháy 5 tấn than đá. Trong khi đó, ở tế bào vi
sinh vật, quá trình phá các lực “ì” diễn ra ở nhiệt độ và áp suất bình thường, đó là
vì tế bào vi sinh vật có hệ enzyme nitrogenase. Ở vi khuẩn đã biết khá rõ bản đồ
gen nif [3], [22]. Chính hệ enzyme này đã xúc tác làm cho nitơ của khí quyển
liên kết với hydro sinh ra trong quá trình trao đổi chất nội bào. Đây là một ưu
điểm của sản xuất phân vi sinh.
Lúc đầu khi người ta chưa biết rằng chỉ ở điều kiện áp suất khí nitơ rất cao
(10
51

+ 3H
2
O NH
2
OH + NH(OH)
2

NH=NH
+2H
H
2
N – NH
2
+2H
2NH
3

-H
2
O
+H
2
O
+H
2
O
2H
N≡N
½ O
2

đánh dấu khi dùng N
18
và N
15
, thấy hydroxylamin (NH
2
OH) ở
Azotobacter vinelandii, nhờ phương pháp đồng vò phóng xạ, phát hiện thấy
hydrazin và hai hợp chất này có thể kết hợp với các ketoaxit để thành các amino
acid (Bem den A.A, 1966). Trong môi trường có vi sinh vật cố đònh đạm thế oxy
hoá khử ở mức thấp, hiệu suất năng lượng của quá trình cố đònh đạm ở điều kiện
kỵ khí cao hơn ở điều kiện hiếu khí. Tất cả những điều đó cho phép chúng ta kết
luận rằng con đường khử N
2
thành NH
3
ở vi sinh vật cố đònh đạm có nhiều cơ sở
vững chắc hơn.
Quá trình cố đònh nitơ phân tử là một quá trình khử liên tục N
2
, sản phẩm
đầu tiên có thể thu được là NH
3
nếu công nhận trong quá trình này có sự vận
chuyển 2 điện tử thì có thể dự đoán sản phẩm của quá trình này là diimit và
hydrazin.
Nitrogenase là tổ hợp nhiều enzyme chứa sắt không liên kết với các nhóm

khử acetylen khi có ATP, feredoxin và ion Mg
+
. Điều đó, một mặt mở ra triển
vọng mới nghiên cứu quá trình cố đònh nitơ phân tử và các thành phần của nó,
mặt khác cho phép phát hiện những sản phẩm trung gian của các khâu cố đònh
nitơ.
1.3. Vi khuẩn Azospirillum
1.3.1. Đặc tính hình thái
Azospirillum được phân lập lần đầu tiên vào năm 1925 từ đất pha cát
nghèo nitơ ở Hà Lan. Sau đó vi khuẩn này cũng được phân lập từ nhiều nguồn
khác nhau : đất và rễ của nhiều loài cỏ nhiệt đới [17].
Hội nghò quốc tế lần thứ nhất về cố đònh nitơ năm 1974 tại Phần lan
Dobereiner và Day là những tác giả đầu tiên đã thông báo về sự hội sinh giữa
Azospirillum với rễ các cây Hòa thảo và những cây khác trồng ở vùng nhiệt đới.
Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này, trong đó có
nhiều thông tin về khả năng tăng năng suất các cây Hòa thảo do nhiễm
Azospirillum [1].
Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn dò dưỡng carbon, vi hiếu khí, tế bào hình
que hơi cong, kích thước tế bào (0,9 -1,2μm), tế bào di động nhờ tiên mao đơn ở
một đầu, trong tế bào có những chuỗi hạt poly-β-hydroxybutyrate (PHB) [23].
Trong môi trường dòch thể tế bào có một tiên mao đơn ở cực còn khi nuôi
một vài loài trên môi trường rắn ở 30
o
C có thêm vài tiên mao mọc ra bên cạnh
tiên mao đơn [23]. Các khuẩn lạc của Azospirillum tạo màu hồng nhạt hay màu
hồng đậm trên môi trường thạch khoai tây [11], [23]. Nhiệt độ tối ưu các loài
Azospirillum vào khoảng 34 - 37
o
C. Một vài chủng phát triển tốt ở pH 7, một vài