TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
MỘT SỐ CÁCH LẤY MẪU MỚI VÀ ẢNH
HƯỞNG CỦA CHÚNG LÊN SỰ TÁI SINH CỦA
MỘT SỐ LOÀI CÂY CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ
Giáo viên hướng dẫn: TS. DƯƠNG TẤN NHỰT
CN. NGUYỄN BÁ NAM
Sinh viên thực hiện: HOÀNG VĂN THƯỞNG
Lớp : 47 CNSH
NHA TRANG, 2009
Click to buy NOW!
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
2
2
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
3
3Hình 1. Giả thuyết về các giai ñoạn phát sinh cơ quan bất ñịnh.
Theo ñó thì sự phát sinh cơ quan phải trải qua hai giai ñoạn cơ bản sau:
• Giai ñoạn một: ñể cho các mô hình thành cơ quan, tế bào của mô ñó phải
có tiềm năng bao gồm khả năng cảm ứng ñược với môi trường và có
những phản ứng biến ñổi trong bản thân nó.
• Giai ñoạn hai: là quá trình xác ñịnh hướng phát triển của tế bào tiềm năng
ñể sau ñó tế bào bước vào giai ñoạn biệt hóa.
Các giai ñoạn này ñều cần ñến sự tác ñộng của hormone. Chỉ có khi bước
vào giai ñoạn biệt hóa thì tế bào không cần ñến tác ñộng của hormone nữa.
1.1.1.1. Tính khả biến
Tế bào thực vật nào cũng mang tính toàn năng nghĩa là khả năng trẻ hóa và
hình thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào thông qua quá trình nuôi cấy in
vitro. Tuy nhiên, khả năng phản phân hóa (bao gồm sự trẻ hóa và tái xác ñịnh con
ñường phát triển mới của mô) không phải lúc nào cũng như nhau trên mọi tế bào.
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
4
4
thành một cây mới. Giai ñoạn các tế bào tiềm năng tiếp xúc với môi trường nuôi
cấy ñược gọi là giai ñoạn cảm ứng của tế bào.
Có rất nhiều giả thuyết ñã ñược các nhà khoa học ñề cập liên quan ñến chức
năng của mô phân sinh trong quá trình cảm ứng của tế bào. Nhiều người cho rằng
chỉ các mô trong vùng phân sinh mới chứa các tế bào tiềm năng. Trong khi một
giả thuyết khác ñược ñặt ra bởi Street (1977) thì cho rằng mặc dù tế bào nào cũng
có tính tiềm năng nhưng các tế bào mới ñược tạo ra ở mô phân sinh lại có ưu thế
hơn các tế bào xung quanh khi bước vào các cơ chế phân chia. Thêm một nhận
ñịnh khác của Cassells (1979) cho rằng các mô phân sinh mới thường bị ức chế
phát triển bởi một loại chất tiết ra từ các mô phân sinh ñã tạo trước nó. Vậy rõ
ràng các tế bào cấu thành nên các mô phân sinh có tiềm năng cảm ứng cao hơn
các loại tế bào khác bởi vì chúng ñã ñược kích thích chuyển sang giai ñoạn biệt
hoá mức ñộ thấp trước khi ñi vào con ñường biệt hoá.
1.1.1.2. Tính xác ñịnh
Các tế bào tiềm năng dưới tác ñộng tích cực của hormone, bắt ñầu ñược lập
trình theo các hướng xác ñịnh ñể trở thành các tế bào chuyên hóa. Tuy nhiên, có
một số tế bào ñã ñược tiền xác ñịnh phát sinh kiểu hình thái cho nên chúng chỉ
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
5
5
Mô phân sinh chồi hình thành trực tiếp từ mẫu cấy thường ñược khởi tạo
bằng sự phân bào sơ cấp sau 48 giờ nuôi cấy. Kế tiếp mỗi quá trình phân bào sơ
cấp là một quá trình phân bào dài và phức tạp hơn, kết quả hình thành nên các
mầm chồi bất ñịnh, mỗi mầm chồi bao gồm nhiều tế bào. Sự hình thành trực tiếp
này thường bắt nguồn từ một hay một nhóm các tế bào sinh dưỡng chưa phân
hoá.
Broertjes và cộng sự (1976), cho rằng trong suốt quá trình phát sinh cơ
quan trực tiếp, các mầm chồi bất ñịnh không phải lúc nào cũng ñược hình thành
từ nhiều tế bào của mô. Một tế bào biểu bì ñôi khi lại khởi ñiểm cho quá trình
phát triển của vùng phân sinh trung tâm là nguồn gốc của 1 cho tới 22 chồi giống
nhau. Các nghiên cứu khác trên một số cây trồng khác cũng khẳng ñịnh giả
thuyết vùng mô phân sinh có nguồn gốc từ một tế bào.
Bảng 1. Các cây trồng phát sinh chồi bất ñịnh từ một tế bào biểu bì
Loài Tham khảo
Achimenes Broertjes (1972)
Begonia Mikkelsen và Sink (1978)
Chrysanthemum Roest (1977)
Kalanchoe Broertjes và Leffring (1972)
Lilium Broertjes và cộng sự (1976)
Sự phát sinh chồi bất ñịnh trực tiếp thường bắt ñầu từ các tế bào nhu mô
nằm ở trong biểu bì (Broertjes và Van Harte, 1978). Từ một nghiên cứu tái sinh
chồi từ thể khảm của lá cây Saintpaulia. Norris và Smith (1981) kết luận rằng sự
khởi tạo vùng mô phân sinh trên ñỉnh liên quan tới sự kết hợp của các tế bào dưới
lớp biểu bì. Chồi trên môi trường nuôi cấy lá Nicotiana tabacum phát sinh trực
tiếp từ các tế bào mô giậu thịt lá quanh rìa lá (Attfield và Evans, 1991). Thể
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
ñộng cho quá trình phân bố mạch và tạo rễ.
1.1.2.2. Tái sinh gián tiếp
Sự hình thành các khối mô sẹo từ mẫu cấy ban ñầu sau khoảng thời gian
nuôi cấy nhất ñịnh ñể hình thành các chồi bất ñịnh. Các chồi này phát triển từ
ngoại vi mô sẹo và không có quan hệ ban ñầu với các mô có mạch dẫn của mẫu
cấy. Sự hình thành cơ quan như thế ñược gọi là quá trình tái sinh gián tiếp.
Sự phát sinh gián tiếp các cơ quan bất ñịnh cũng tương tự như sự phát sinh
trực tiếp, bắt ñầu bằng sự phân chia nhanh các tế bào ñể dẫn tới sự hình thành
vùng phân sinh. Tiếp theo là sự xuất hiện các mầm chồi và cuối cùng là chồi
(Torrey, 1966). Vì vậy, rất khó phân biệt hai hình thức phát sinh cơ quan này.
Thường ñể sự phát sinh cơ quan gián tiếp xảy ra, các mô sẹo hình thành từ mẫu
cấy phải ñược cấy chuyền sang môi trường chứa chất ñiều hòa sinh trưởng thực
vật thích hợp cho quá trình biệt hóa mô sẹo.
ðối với mục ñích nhân giống in vitro, nếu cây tái sinh trực tiếp từ mẫu cấy
ban ñầu thì không những nhanh chóng thu ñược cây, mà các cây này cũng khá
ñồng nhất về mặt di truyền. Tế bào mô sẹo sau khi cấy chuyền nhiều lần sẽ
không ổn ñịnh về mặt di truyền. ðể tránh tình trạng ñó nhất thiết phải sử dụng
loại mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp ñể tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu
ñược cây tái sinh ñồng nhất.
1.1.3. Vết thương
Quá trình tạo vết thương bằng các tác ñộng cơ học vào mẫu cấy như cắt, tỉa
thường kích thích sự tái sinh. Tất cả các mẫu cấy khi ñược nuôi cấy in vitro ñều
phải qua quá trình xử lý với kéo, dao cấy hoặc các dụng cụ khác vì thế mẫu luôn
bị tổn thương. Mẫu cấy càng nhỏ thì tỷ lệ bề mặt vết cắt càng lớn. Trong nhiều
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
ñoạn cắt lá mầm và chồi mầm khá cao. Tỷ lệ tạo chồi từ các mẫu cấy rễ mầm của
‘Delicious’ và ‘Winesap’ lần lượt là 0% và 11%. Korban và Skirvin (1985) cho
rằng các tác ñộng trong quá trình phân chia mẫu cấy phôi làm loại bỏ tác nhân tái
sinh ñã từng tồn tại trước ñó ở vùng rễ mầm hoặc tăng hoạt tính của một số chất
ức chế ở vùng này.
Trong một số trường hợp, mẫu cấy không cảm ứng ñược kích thích của các
chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật nếu chúng không ñược tạo vết thương, ñiển
hình như mầm chồi của cây xương rồng Opuntia polycantha, nó không phản ứng
với auxin hay cytokinin trong môi trường nếu như không bị tổn thương. Các mẫu
cấy này sau ñó hình thành rễ bất ñịnh trên môi trường có 10 mg/l NAA và chồi
bất ñịnh trên môi trường có 10 mg/l IBA (Mauseth và Halperin, 1975).
1.1.3.2. Vết thương phụ
Ngoài những vết thương bắt buộc phải có khi tách mẫu ra khỏi cây ban ñầu
ñem vào nuôi cấy, những vết thương tạo thêm nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc
của mẫu cấy và khả năng tái sinh mẫu ñược gọi là vết thương phụ.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
hòa khác. Nhiều biến ñổi hình thái của cây trồng chỉ phát sinh trong những ñiều
kiện môi trường ñặc hiệu. Chính vì tính ñặc trưng của hệ gene mà môi trường
nuôi cấy thường khác nhau từ các chi hay loài thậm chí các thứ trong cùng một
họ. Không có môi trường nào chuyên biệt cho cây trồng nào mà phải qua hàng
loạt các nghiên cứu thử nghiệm ñể xác ñịnh môi trường tốt nhất cho cây trồng ñó.
Nếu như sự tương tác giữa môi trường – kiểu gene là tính ñặc hiệu duy nhất
của hệ gene, thì chúng ta có thể nuôi cấy tất cả các cây trong cùng khu sản xuất,
có ñặc ñiểm y như nhau với kết quả thu ñược là như nhau. Tuy nhiên, sự biểu
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
9
9
hiện khác nhau của cây trồng thông qua quá trình nuôi cấy in vitro như sự hình
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
10
10
Kích thước của mẫu cấy có ảnh hưởng trực tiếp ñến phản ứng của mô với
môi trường nuôi cấy. Các kích thước nhỏ khó tái sinh hơn mẫu có kích thước lớn
do mẫu lớn có nguồn dinh dưỡng dự trữ dồi dào hơn và kích thích tố ñể duy trì sự
nuôi cấy. Tuy nhiên, kích thước mẫu cấy cũng có tương tác với nhiều nhân tố
khác như tuổi mẫu cấy. Trong quá trình nuôi cấy mô Cumcumis melo thì tỷ lệ
chồi bất ñịnh thu ñược cao khi nuôi cấy những lá nhỏ (0,3 – 0,5 mm) và non (14
ngày) hơn các lá có cùng kích thước nhưng già (21, 28, 35 ngày), hay từ các lá có
kích thước lớn (0,6 – 0,9 mm hay 1,0 – 1,2 mm) ở bất cứ ñộ tuổi nào (Kahal và
cộng sự, 1988).
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
11
11
Mật ñộ nuôi cấy tối thiểu ñể tạo ra các tế bào hay mô phát triển in vitro ñã
từng ñược ñề cập trước ñây. Bên cạnh sự ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, mật
ñộ nuôi cấy cũng ñược cho rằng ảnh hưởng ñặc biệt tới sự phân hóa tế bào, sự tái
sinh hay sự nhân chồi.
Khi nuôi cấy huyền phù tế bào Cà rốt, cả số lượng phôi soma hình thành và
cả trạng thái phát triển tế bào khi ở giai ñoạn phôi ñược coi là phụ thuộc vào số
lượng tế bào khi bắt ñầu nuôi cấy. Khi tiến hành làm loãng dịch nuôi cấy thì kết
quả là sự gia tăng các tế bào vô ñịnh hình. Không chỉ thể hiện ở số lượng phôi
hình thành ít hơn mà những phôi hình thành có kích thước nhỏ hơn và sinh
trưởng chậm hơn (Halperin, 1967). Hari (1980) chỉ ra rằng những tế bào không
thể hình thành dạng phôi hoàn chỉnh ở tại mật ñộ nuôi cấy quá cao hoặc quá thấp.
ðiều này càng khẳng ñịnh bằng nhiều nghiên cứu khác ở Cà rốt, khi mật ñộ nuôi
cấy các tế bào quá thấp (nhỏ hơn 10
4
tế bào/ml môi trường) dẫn tới sự chết của tế
bào mặc dù ñiều kiện môi trường hoàn toàn tối ưu cho quá trình phát triển
(McCabe và cộng sự, 1997).
Ảnh hưởng của mật ñộ mẫu cấy ñược công bố bởi Pierik và Steegmans
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
12
12
• Auxin ở dạng tự do: là dạng có hoạt tính sinh học. Chúng tồn tại ở ñỉnh
sinh trưởng ngọn, sau ñó rồi ñến chồi bên, ñầu rễ và cơ quan non. Càng xa ñỉnh
sinh trưởng nồng ñộ auxin tự do càng giảm dần. Dạng auxin tự do chủ yếu trong
cây là IAA. Auxin tự do trong cây chiếm một tỷ lệ rất thấp. Nhiều tài liệu ñã
công bố hàm lượng auxin tự do trong cây chiếm khoảng 5% auxin tổng số.
• Auxin dạng liên kết: là dạng auxin chủ yếu trong cây. Hàm lượng của
dạng liên kết này có thể chiếm trên 90% lượng auxin có trong cây. IAA có thể
liên kết với rất nhiều các hợp chất khác nhau nên chúng không có hoạt tính sinh
học hoặc có hoạt tính sinh học rất thấp. Tuy nhiên, chức năng của auxin liên kết
trong cây hết sức quan trọng. Chúng là nguồn dự trữ auxin trong cây và cũng là
dạng auxin vận chuyển chủ yếu trong cây. Vì vậy, sự biến ñổi thuận nghịch của
IAA tự do và IAA liên kết dưới tác nhân kích thích của môi trường góp phần ñiều
chỉnh sự cân bằng auxin trong cây và do ñó ñiều chỉnh quá trình sinh trưởng của
cây.
Auxin ñược tổng hợp trong ñỉnh ngọn và từ ñó vận chuyển xuống các cơ
quan phía dưới. Sự vận chuyển của auxin trong cây có tính phân cực rõ rệt, theo
hướng gốc, tức là từ ngọn xuống rễ mà không vận chuyển ngược lại.
Trong cây nguyên vẹn, auxin liên quan ñến sự phân chia tế bào, sự hình
thành mô sẹo (trong suốt quá trình mẫu bị tổn thương và cảm ứng vết thương), và
sự hình thành rễ bất ñịnh. Ngoài IAA là auxin tự nhiên phổ biến nhất, những
auxin tổng hợp cũng ñược sử dụng phổ biến như IBA, NAA, 2,4-D.
IAA là loại auxin không ổn ñịnh nhất trong các auxin, nó dễ dàng bị phân
hủy bởi ánh sáng và bị oxy hóa. Tính không ổn ñịnh này làm IAA không ñược sử
dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật. 2,4-D là auxin có hoạt tính khá mạnh và
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
Cytokinin tồn tại ở trong cây dưới dạng tự do có hoạt tính sinh học và dạng
liên kết không có hoạt tính sinh học hoặc hoạt tính yếu.
Hiệu quả sinh lý của cytokinin: giãn nở của tế bào, sự phân hóa chồi, sự
hóa trẻ.
Trong cơ thể thực vật thì cytokinin liên quan ñến sự phát triển các búp chồi
và sự phát triển, trưởng thành của lục lạp. Các cytokinin tự nhiên dùng trong nuôi
cấy mô có thể kể ñến là Zeatin, 2-iP. TDZ là một cytokinin tổng hợp ñược dùng
xuyên suốt trong quá trình nuôi cấy mô.
Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin thường ảnh hưởng trực tiếp ñến quá trình
phát sinh cơ quan:
Auxin : cytokinin > 1 kích thích tạo rễ
Auxin : cytokinin < 1 kích thích tạo chồi
Auxin : cytokinin = 1 kích thích tạo mô sẹo
1.2.2.7. Sự phân cực
Tính phân cực phụ thuộc vào khả năng trao ñổi ion H
+
và K
+
của tế bào tại
màng plasma. Auxin tạo ra dòng chảy của H
+
từ trong tế bào ra bên ngoài tế bào
và ñồng thời duy trì một ñiện thế trong các mô (dương ở phía ngọn, âm ở phía
gốc lá), duy trì và củng cố dòng vận chuyển auxin (Raven, 1979). Khi tách các
mô chồi và rễ thì tính có cực này bị khử, nhưng trong quá trình nuôi cấy thì tính
có cực của tế bào ñược khôi phục lại, thường là khoảng 4 – 6 giờ ở rễ và 12 – 16
giờ ở trụ trên lá mầm cây ñậu (Hanson và Trewavas, 1982).
Gradient tái sinh
Thường thấy khi cắt một cơ quan hoàn chỉnh thành nhiều phần thì các ñoạn
cắt này thể hiện khả năng tái sinh theo chiều hướng khác nhau. Tùy theo sự hình
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
mẫu lá non từ giống Dâu tây ‘Redcoat’ lại có khả năng sinh ra nhiều chồi bất
ñịnh hơn khi mặt bụng (so với mặt lưng) của mẫu cấy lá tiếp xúc với môi trường
nuôi cấy (Nerha và cộng sự, 1988), những kết quả tương tự thu ñược với mẫu cấy
lá của Malus domestica và Malus pumila. Welander (1988) lý giải ñiều này, bên
cạnh tính có cực, trong các nghiên cứu này thì dường như bề mặt trên của lá phản
ứng tốt nhất với môi trường dinh dưỡng khi chứa những tế bào không ngừng lớn
lên và phân chia.
Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật và sự vận chuyển có cực
Sự phân cực tái sinh một phần cũng do sự di chuyển của các chất ñiều hòa
sinh trưởng có trong mẫu cấy, ñặc biệt là sự di chuyển hữu cực (ví dụ như từ ñỉnh
chồi ñi xuống các phần dưới) của IAA. Kiểu di chuyển có cực này không rõ ràng
ở những mẫu cấy nhỏ, ñiều này phần nào giải thích ñược tạo sao các mẫu cấy có
kích thước nhỏ thì sự tái sinh phân cực không ñược quan sát (Thakur và
Ganapathi, 1978). Sự bổ sung auxin và cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể
tăng cường tính phân cực của mẫu cấy, kích thích tái sinh hoặc dẫn tới sự biến
mất hay ñảo ngược xu hướng phân cực.
Sự ñảo ngược và biến mất của quá trình phân cực khi có mặt các chất ñiều
hòa sinh trưởng thực vật ñược ñưa ra bởi nghiên cứu của Margara (1969) trên cây
Súp lơ, Nho và Thu Hải ðường. Trên môi trường không có chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật, cuống lá cây Súp lơ tạo ra chồi và rễ ở vùng gần ñiểm cắt, nhưng
tính có cực này bị phân hủy khi bổ sung 1,9 mg/l NAA vào môi trường, khi ñó
trên bề mặt mẫu cấy ñều hình thành các rễ bất ñịnh. Trái lại, khi thêm vào môi
trường nuôi cấy 2,3 mg/l BA thì tất cả các mẫu cấy ñều phát sinh chồi. Sự hình
thành chồi ở cuống hoa Nho cũng ñược quan sát khi nuôi cấy trên môi trường có
nồng ñộ thấp auxin và cytokinin, nhưng hiện tượng này không ñược rõ ràng khi
nồng ñộ các chất ñiều hòa sinh trưởng tăng (Margara và Leydecker, 1969). Nuôi
Click to buy NOW!
P
D
F
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
một số mô hay tế bào chuyên biệt, hoặc tạo ra một cơ quan ñặc biệt trong nuôi
cấy in vitro.
2.1. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (THIN CELL LAYER)
2.1.1. ðịnh nghĩa của hệ thống thin cell layer (TCL)
Thực vật có những ñặc ñiểm nổi bật là có thể tái chương trình biệt hóa sự
phát triển của cơ thể và có khả năng xây dựng quá trình phân chia chức năng mới
(mô sẹo, rễ, chồi, phôi soma và hoa), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trường
hợp hình thành cấu trúc mới là chồi và phôi soma, cá thể mới có thể hình thành
mà không cần quá trình giảm phân và sinh sản hữu tính sự phát triển bên trong
thực vật ñược kiểm soát về không gian và thời gian trong một mạng lưới các ñơn
vị khác nhau: cơ quan, mô, tế bào. Nếu như có sự thay ñổi trong mạng lưới này
thì sự ức chế ở mức cá thể có thể xảy ra. Khái niệm về phương pháp TLC là cô
lập tế bào từ mạng lưới ức chế và tái chương trình chúng bằng nuôi cấy in vitro
(Nhựt và cộng sự, 2003).
Hệ thống TLC bao gồm các mẫu mô có kích thước nhỏ ñược thu nhận từ
các cơ quan khác nhau của thực vật (thân, rễ, lá, cụm hoa, chồi hoa, các cơ quan
của hoa, lá, mầm, mô phân sinh, ñỉnh sinh trưởng hoặc phôi).
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
“kiểm soát” sự phát sinh hình thái.
Một hệ thống ña bào như hệ thống TCL mang sự tổ chức không gian/thời
gian của cơ thể ban ñầu. Khác với khi sử dụng một tế bào ñơn hay thậm chí tế
bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào với
tổ chức không gian/thời gian khác biệt với tổ chức trước khi tiến hành quá trình
tách ra từ mô hay cơ quan cho (Tran Thanh Van, 1973).
Việc giảm số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa
rất quan trọng ñến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ
quan. Các chương trình biệt hóa có thể thay ñổi từ việc biến ñổi mối tương quan
giữa cơ quan/mô nuôi cấy với kích thước khác nhau khi nuôi cấy trên môi trường
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
17
17
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
18
18
TCL cho phép tái sinh thành một cơ quan chuyên biệt dưới một số ñiều
kiện như:
− Môi trường ñược kiểm soát chặt.
− Chất ñiều hòa tăng trưởng ngoại sinh ñược ñưa vào trong môi trường
nuôi cấy.
− Bổ sung các chất khác vào môi trường.
Hệ thống TCL là một hệ thống ñơn giản, một mô hình tốt ñể nghiên cứu
lãnh vực cơ bản hay nghiên cứu vào chuyển gene và tái sinh. TCL ñược sử dụng
ñển nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo phôi, tạo cơ quan ở một số lượng lớn các
loài thực vật. TCL còn là một phương pháp hiệu quả ñể nhân giống một số lượng
lớn thực vật hoặc cơ quan với những tính trạng mong muốn, quy mô rộng, hiệu
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
19
19
khác nhau trong ñiều kiện chiếu sáng liên tục ở 3240 lux, 24 – 27
0
C, ñộ ẩm 50%
(Tran Thanh Van, 1980, 1981, Tran Thanh Van và Trinh, 1996). Trạng thái hoa
có thể thay ñổi sang trạng thái sinh dưỡng bằng cách bổ sung vào môi trường
oligosaccharide (thành phần của vách tế bào), oligosaccharide phóng thích các
chất ñiều sinh trưởng trong nghiên cứu hệ thống TCL (Tran Thanh Van và cộng
sự, 1985) hoặc từ sự thay ñổi pH có thể hoạt hóa như dấu hiệu phân tử.
Như vậy, ngoài việc tất cả các cơ quan và mô sẹo phát sinh từ lớp biểu bì
còn có yếu tố khác kiểm soát sự phát sinh hình thái từ hệ thống TCL có thể thực
hiện là ñiều khiển ánh sáng, nồng ñộ ñường, oligosaccharide, thành phần ion
trong môi trường nuôi cấy và ñộ pH (Cousson và Tran Thanh Van, 1992).
Cây hoa Lily
Lily là một trong những loài hoa cắt cành ñẹp có giá trị và ñang nhanh
chóng trở thành loài hoa xuất khẩu quan trọng. Tuy nhiên phương pháp nhân
giống vô tính Lily bằng vảy củ, cũng như hệ thống vi nhân giống không mang lại
hiệu quả cao. ðiều này ñã thúc ñẩy mạnh các nghiên cứu sau về hệ thống TCL
trên cây hoa Lily như một công cụ và giải pháp nhằm khắc phục các nhược ñiểm.
Chính tính sâu sắc của nghiên cứu này cùng với sự thành công trong tất cả các
chương trình phát sinh hình thái trên cây hoa Lily, chúng ñã ñược sử dụng như
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
20
3.1.1. Cây hoa Thu Hải ðường
Nhóm Begonia là một trong các nhóm lớn nhất trong các loại cây cảnh. Có
rất nhiều loài ñược phát hiện, có vô số các loài cây lai khác nhau. Cây Thu Hải
ðường ñầu tiên ñược ñưa vào nước Anh năm 1777. Từ ñó ñến nay, ñã có rất
nhiều giống Thu Hải ðường mới ñược tạo ra với vô số màu sắc rực rỡ ở hoa và
lá.
Sự phân bố của cây Thu Hải ðường có tính chất khu vực. Thu Hải ðường
ñược phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới như ở vùng Trung và
Nam Mĩ, Châu Á và Châu Phi. Nó ñược trồng trong vườn, trong chậu trong giỏ
treo có dáng lá và hoa ñẹp.
Trong tự nhiên, cây Thu Hải ðường thích hợp với loại ñất có tính acid nhẹ
ẩm, có bóng râm, ở sườn ñồi, nói chung là nơi có khả năng thoát nước cao và có
ñộ ẩm lớn. ðộ pH của ñất từ 5,5 – 6,5.
Hiện nay người ta tạm chia Begonia thành các nhóm nhỏ sau: Rex begonia,
Cane begonia, Semperfloens bengonia, Tuberous begonia, Trailing begonia và
Thick-stemmed begonia.
3.1.1.1. Vị trí phân loại
Giới : Plantae
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Bộ : Cucurbitaless
Họ : Begoniaceace
Chi : Begonia
Loài : Begonia spp.
3.1.1.2. ðặc ñiểm hình dạng của cây Thu Hải ðường
Cây hoa Thu Hải ðường thuộc cây thảo mọng nước. Thường màu hồng, lá
có phiến lá lệch rất rõ ở gốc, cụm hoa sim hai ngả, cuống dài.
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
cây này có hàm lượng fructose cao nên ñược sử dụng như nguồn gia vị ở
Philippines và Brazil. Ở Trung Quốc, Indônêxia, Brazil, lá Thu Hải ðường ñược
dùng như rau ăn tươi. Một số giống Thu Hải ðường có tác dụng như là một
nguồn dược liệu tự nhiên dùng thanh nhiệt, giải ñộc, trị ho ra máu, giảm ñau,
chữa tê bại, di chứng sau bệnh viêm màng não, thuốc xổ, thuốc mê, chống ung
thư.
3.1.1.4. Một số nghiên cứu in vitro trên cây hoa Thu Hải ðường
Các phần khác nhau của cây như lá, cuống lá, thân hay cụm hoa ñược sử
dụng trong vi nhân giống trong ñó các phiến lá ñược xem là nguồn mẫu thích hợp
nhất bởi vì chúng có thể tái sinh ñược nhiều chồi giúp nhân giống số lượng lớn.
Môi trường MS ñược chọn là môi trường thích hợp nhất và phổ biến ñể nuôi cấy
mô Begonia. Welander (1977) ñã nhân giống từ mẫu cấy là chồi ñỉnh trên môi
trường Welander (1974) có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA.
Hakkaart và Versluijs (1984) ñã giới thiệu việc nuôi cấy chồi ñỉnh của
giống Elatior begonia giúp hạn chế sự nhiễm khuẩn, Elatior begonia có giai ñoạn
ngủ ngắn vào mùa xuân và mùa hè hơn so với giai ñoạn mùa ñông. Mặc dù
những cây mẹ ñã nhiễm bệnh nặng nhưng khi nuôi cấy chồi ñỉnh với kích thước
0,15 mm thì có thể tạo ñược các cây con in vitro sạch bệnh trên môi trường nuôi
cấy trong 6 – 12 tháng.
Reuter (1980) ñã thu ñược cây con từ mẫu lá có kích thước 5 x 5 mm trên
môi trường MS có bổ sung cytokinin và IBA.
Bigot (1981) ñã thu ñược kết quả tốt khi nuôi cấy mẫu lá (7 mm) trên môi
trường khoáng MS có bổ sung vitamin, 0,54 – 2,2 mg/l NAA, 4,9 – 14,7 mg/l 2-
iP, 90 g/l sucrose và 8 g/l agar.
Takayama và Misawa (1981) ñã thu ñược cây con khi nuôi cấy mẫu lá trên
môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose. Peck và Cumming (1984) ñã nhận thấy
Click to buy NOW!
P
D
F
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
tương ñương với mẫu có nguồn gốc từ lá (Bigot, 1981).
Mikkelsen và Sink (1978) ñã nuôi cấy cuống lá (5 mm) trên môi trường MS
có bổ sung 0,05 mg/l NAA, 1,8 mg/l BA, 90 g/l sucrose và 8 g/l agar ñể tái sinh
số lượng lớn các cây trong vòng 16 tuần.
Bigot (1981) ñã nuôi cấy lá (7 mm), cuống lá (10 mm), ñoạn thân (10 mm),
cụm hoa trên môi trường MS có bổ sung từ 0,54 – 2,2 mg/l NAA, 4,9 – 14,7 mg/l
2-iP, 90 g/l sucrose và 8 g/l agar cho thấy rằng mẫu lá và cuống lá có sự tái sinh
tốt nhất.
Imelda (1983) ñã ñạt ñược sự tái sinh chồi tối ưu trên môi trường MS có bổ
sung 0,1 mg/l NAA và 0,2 – 0,4 mg/l 2-iP. Sự kích thích của GA
3
ñối với cây con
ở nồng ñộ 0,1 mg/l mà không cần sự tham gia của cytokinin (BAP và 2-iP) ñược
xem là tốt nhất, sự tạo chồi bất ñình nhiều nhất ở các mẫu cuống lá trên môi
trường có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA nhưng hạn chế sự sinh trưởng
của chồi. Nếu dùng nồng ñộ BA thấp hơn (0,1 mg/l) thì cho chồi ít hơn nhưng
kích thích sự tăng trưởng của chồi (Simmonds, 1984). ðối với môi trường bán
rắn có nồng ñộ BA thấp (0,1 mg/l) thì cho chồi có kích thước dài hơn so với nồng
ñộ BA cao (0,5 mg/l). Tanimoto và Kagi (1984) ñã nuôi cấy chồi và mẫu cuống
lá của giống Schwabenland Red in vitro trên môi trường MS lỏng có chứa các giá
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
ñiều kiện chiếu sáng liên tục. Bằng phương pháp này, cấy chuyền lặp lại thì có
thể thu ñược từ 10 – 14 chồi hoặc nhiều hơn trên một mẫu lá non có kích thước 7
x 7 mm.
Simmonds và Werry (1987) khi nuôi cấy mẫu cuống lá ñã thu ñược lượng
lớn chồi bất ñịnh nhưng sau 9 tuần nuôi cấy trên môi trường ñặc, thì chỉ có một
số ít chồi có kích thước ñủ lớn ñể dùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô. Chu kỳ
nuôi cấy lỏng lắc kích thích sự tăng trưởng của chồi. Thời gian tối ưu ñể bắt ñầu
nuôi cấy lỏng là sau khi nuôi cấy trên môi trường rắn (agar) ñược 6 tuần. Phương
pháp này ñã làm tăng một cách ñáng kể số lượng cây con. GA
3
khi ñược dùng
trong nuôi cấy lỏng sẽ kích thích sự phát triển của chồi nhưng khả năng ra rễ của
những chồi này lại không tốt, do ñó khả năng tạo ra các cây con hoàn chỉnh ña
phần bị giảm ñi.
Khi nuôi cấy mẫu lá và mẫu cuống lá của giống Begonia tuberous lai trên
môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA, Nakano và cộng sự
(1999) ñã thu ñược những chồi bất ñịnh có kích thước trên 10 mm (8 – 9
chồi/mẫu). Chồi ñược nhân lên một cách hiệu quả bằng nuôi cấy lắc các chồi (tạo
từ lá) trong môi trường lỏng bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA. Trong khi ñó
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
Van, 1975).
3.1.2. Cây hoa Torenia
Torenia, Wisihsbone Flower và Bluewings là các tên thường gọi của các
loài hoa Torenia (T. fourwieri, T. concolor, T. xhybrida và T. asiatica). Torenia là
loại cây hai lá mầm, thân thảo lâu năm. Torenia còn ñược gọi là mắt biếc hay mắt
nai, có nguồn gốc từ châu Á và châu Phi, ñược ưa chuộng bởi cánh hoa mềm
mại, xinh xắn, dễ trồng, dễ chăm sóc.
3.1.2.1. Vị trí phân loại
Giới : Plantae
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Copyright: Tài liệu đại học ©