Bộ khoa học và công nghệ
Viện ứng dụng Công nghệ
Trung tâm sinh học thực nghiệm

C6 Thanh Xuân Bắc, Hà Nội

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài:
Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và
bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ
ngành nuôi trồng thuỷ sản

TS.Hoàng Thị Kim HOa 6123
25/9/2006

Hà nội, 12-2005 Mục tiêu:
- Đa ra qui trình phân lập làm sạch và bảo quản 5 giống vi tảo có giá trị dinh
dỡng cao ứng dụng trong nhân giống thuỷ sản là Dunaliella salina,
Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella
vulgaris.
- Từng bớc xây dựng tập đoàn giống tảo có chất lợng tốt để cung cấp cho
các cơ sở sản xuất giống thuỷ sản.

Nội dung:
- Nghiên cứu qui trình bỏ tảo lạ và động vật phù du tạo 5 giống tảo thuần
(Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis
galbana, Chlorella vulgaris).
- Nghiên cứu ảnh hởng của một số loại kháng sinh lên sinh trởng của tảo và
vi sinh vật.
- Nghiên cứu bảo quản thử 5 giống tảo bằng kĩ thuật làm bất động.
- Đề xuất qui trình phân lập làm sạch và bảo quản giống tảo.
1
Lời mở đầu

Trong một số công trình nghiên cứu trớc đây chúng tôi đã giới thiệu về
giá trị dinh dỡng của vi tảo biển và sự cần thiết sử dụng tảo làm thức ăn cho con
giống trong nuôi trồng nhân giống nhân tạo các loài hải sản. Do các loài vi tảo
biển có giá trị dinh dỡng cao, giàu các chất có hoạt tính sinh học rất phù hợp
cho động vật biển giai đoạn còn non nên ở các nớc có ngành nuôi trồng thuỷ
sản phát triển, vấn đề sản xuất tảo ở các trại giống rất đợc chú trọng. Kinh phí
đầu t cho việc sản xuất tảo chiếm tới 50% kinh phí của trại giống.
ở nớc ta, trong những năm gần đây các loài vi tảo biển đã đợc nuôi
trồng phục vụ nhân giống hải sản ở nhiều trại giống. Tuy nhiên việc sản xuất tảo
ở các trại giống hải sản hiện nay gặp rất nhiều khó khăn do cha có nguồn giống
ổn định. Thực tế cho thấy các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi trồng đều bị
nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du, làm giảm năng suất
và chất lợng tảo, ảnh hởng đến quá trình sản xuất giống hải sản. Vì vậy cần có
nguồn giống tốt để thờng xuyên cung cấp cho sản xuất.
Việc nghiên cứu qui trình phân lập, làm sạch và bảo quản lâu dài một số
giống tảo có giá trị kinh tế cao để cung cấp giống chủ động, ổn định, kịp thời
cho việc sản xuất giống thuỷ sản tại các trại giống là hết sức cần thiết.


ăn tảo với chất lợng cao, muốn vậy nguồn giống tảo cho quá trình sản xuất sinh
khối phải đạt chất lợng tốt. Thờng các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi
trồng đều bị nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du. Để đáp
ứng nguồn tảo giống cho các trại sản xuất thờng xuyên phải cung cấp giống
mới (sạch, tốt) từ tập đoàn giống gốc. Vì vậy, giống cần đợc thờng xuyên phân
lập và bảo quản trong điều kiện thích hợp. ở các nớc có ngành nuôi trồng thuỷ
sản phát triển nh Mỹ, úc, Tây Ban Nha, Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan, Hàn
Quốc, Singapore đều có các cơ sở cung cấp giống tảo chất lợng cao và các

3
dịch vụ đi kèm nhằm đảm bảo có giống tốt, cung cấp ổn định cho sản xuất. Tuy
nhiên việc phân lập tảo gặp nhiều khó khăn do kích thớc tế bào tảo nhỏ, sống
kết hợp với vi sinh vật và các loài ký sinh khác. Vì vậy việc tách vi khuẩn khỏi
tảo là rất khó. Gerloff và cộng sự (1950), Kbutko (1961) đã làm sạch tảo lam
bằng cách sử dụng tia cực tím. Tuy nhiên phơng pháp này có nhợc điểm là có
thể gây đột biến di truyền. Baccep và cộng sự (1989) đã sử dụng phơng pháp
cấy tảo trên thạch. Sau đó chọn khuẩn lạc mong muốn và cấy tiếp vào môi
trờng lỏng để tảo phát triển, tiếp tục lấy tảo từ môi trờng lỏng cấy tiếp vào môi
trờng thạch. Quá trình đợc lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đợc tảo sạch.
Cách phân lập này hiện nay vẫn đợc sử dụng phổ biến.Tuy nhiên với phơng
pháp nh trên tốn rất nhiều thời gian và cũng không loại bỏ đợc vi khuẩn bám
chặt vào lớp nhầy quanh tế bào tảo. Stein (1973) cho thấy tảo sạch cũng có thể
nhận đợc bằng cách rửa kỹ và sử dụng một hoặc nhiều loại kháng sinh để diệt
khuẩn nhng không nêu sử dụng loại kháng sinh nào
Để nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian phân lập, Alenkhina và cộng sự
(2001) đã sử dụng chất diệt khuẩn Methiolat để tách vi khuẩn ra khỏi tảo lam.
Kết quả cho thấy nồng độ Methiolat 2ppm có tác dụng diệt khuẩn nhng không
làm ảnh hởng đến sinh trởng của chủng tảo lam nghiên cứu. Việc nghiên cứu
làm sạch khuẩn các loài vi tảo biển nói chung và các chủng tảo Dunaliella
salina, Nannochloropsis oculata, Isochrryis galbana, Tetraselmis chuii,

dụng các hoá chất chống lạnh gây độc đối với tế bào và có thể làm ảnh hởng
đến khả năng sống của tảo. Điều này đã đợc mô tả đối với tảo Chlorella
(Moris.1976), tảo khuê (Mclellan, 1989) và Tetraselmis suecica (Fenwiek and
Day, 1992). Ngoài ra, sử dụng kĩ thuật đông lạnh còn đòi hỏi một số thiết bị đặc
chủng, chi phí cao, khó thực hiện. Vì vậy, công nghệ bảo quản mang tính u việt
hơn: ít phức tạp, chi phí thấp, phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm và cơ sở
sản xuất đang đợc các nhà khoa học nghiên cứu áp dụng. Đó là bảo quản tảo
bằng cách làm bất động (immobilization) (Tamponet và cộng sự ,1985; Hertherg
and Jensen, 1989; Susana Romo and Carmen Berer-Martiner ,1997; Yean-
Chang-Chen, 2001,2003) .Kết quả nghiên cứu của Tamponnet và cộng sự (1985)
và Hertzberg and Jensen (1989) cho thấy các giống tảo khuê đợc làm bất động
trong gel vẫn duy trì đợc cấu trúc nguyên vẹn và hoạt tính sinh lí trong một số
tháng, điều này gợi ý có thể sử dụng kĩ thuật này trong bảo quản giống tảo. Tuy
nhiên các tác giả trên cũng lu ý rằng trong 7 giống tảo thí nghiệm thì chỉ có 2
giống tảo Phaeodactylum tricornutam và Skeletonema costatum là cho kết quả

5
tốt. Tác giả Susana Romo and Carmen Perez Martinez (1997) đã thử nghiệm kĩ
thuật làm bất động để bảo quản giống tảo lam Pseudanabaena galeata Bocher
(cyanobacteria) và đánh giá khả năng sống, đặc điểm sinh lí, sinh hoá và cấu trúc
của chúng sau thời gian bảo quản 14-18 tháng. Kết quả cho thấy tảo sau khi
đợc bảo quản tỉ lệ sống đạt 93%, sinh trởng tốt, không có sự khác biệt về cấu
trúc tế bào, sinh hoá và tốc độ sinh trởng giữa tảo thí nghiệm và tảo đối chứng.
Các tác giả trên nhận xét việc xử lí dờng nh không có ảnh hởng đến khả năng
sinh trởng và chức năng của tảo Pseudanabaena galeata, hàm lợng C, H, N và
P trong tế bào tảo đợc bảo quản và tế bào tảo đối chứng không có sự khác biệt
đáng tin cậy. Tảo sau khi bảo quản đợc đa vào môi trờng thích hợp để sinh
trởng.
Tác giả Yean-Chang-Chen (2001) đã nghiên cứu kĩ thuật làm bất động
Scenedesmus quadricauda trong hạt gel để bảo quản tảo lâu dài. Tảo đợc cố

tảo nhân nuôi con giống gặp nhiều khó khăn. Ngoài ra, việc giữ giống thờng
đợc thực hiện bằng cách nuôi tảo trong môi trờng lỏng, trong tủ mát với nhiệt
độ 15-17
o
C. Trong điều kiện này tảo phát triển nhanh và dễ bị nhiễm tạp tảo lạ
và vi khuẩn. Hiện nay công nghệ bảo quản bằng kỹ thuật làm bất động ở Việt
Nam cha đợc nghiên cứu áp dụng. Vì vậy việc nghiên cứu qui trình làm sạch
tảo (bao gồm phân lập, loại bỏ tảo lạ, động vật phù du và làm sạch khuẩn tiến tới
xây dựng tập đoàn giống có chất lợng tốt và nghiên cứu kỹ thuật nhằm bảo
quản lâu dài các giống tảo nhằm chủ động phục vụ sản xuất là hết sức cần thiết.
Với mục đích trên chúng tôi đề xuất đề tài Nghiên cứu qui trình công nghệ
phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục
vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản.

7
Phần II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu.
II.1. Đối tợng nghiên cứu.
Đối tợng nghiên cứu là tảo Dunaliella salina, Tetraselmis chuii,

nhiều trong nuôi trồng thuỷ sản. Trong tảo chứa khoảng 5% EPA và 7% DHA,
đặc biệt trong tảo này có chứa axit béo 20 : 5
n-3
và sterol 24-methychlesterol
hoặc 24-methylenecholesterol với hàm lợng cao. Các hợp chất trên có rất ít
trong thực vật phù du và rất thích hợp cho sinh trởng của ấu trùng động vật biển
nói chung và động vật thân mềm 2 mảnh vỏ nh ngao, sò, hầu (Wikfors et al,
1991)
Chlorella vulgaris là tảo lục giàu dinh dỡng đợc sử dụng nhiều trong
nuôi trồng thuỷ sản, ngoài việc làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng động vật biển
(tôm, động vật 2 mảnh vỏ) ở một số giai đoạn phát triển, Chlorella vulgaris còn
có tác dụng rất tốt trong xử lí nớc ao nuôi, gây màu nớc
II.2 Phơng pháp nghiên cứu
Phơng pháp phân lập, làm sạch tảo: dịch tảo đợc làm sạch sơ bộ bằng
cách lọc qua vải lọc hoặc bông để loại bỏ tạp chất, tảo sợi và ộng vật phù du.
Sau đó tiến hành ly tâm để xác định tốc độ và thời gian ly tâm thích hợp đối với
từng chủng tảo, dựa vào đó có thể ly tâm tách tảo để thu đợc sinh khối chủng
tảo mong muốn. Từ sinh khối tảo thu đợc tiến hành phân lập theo 2 phơng
pháp: phân lập trên môi trờng thạch và phân lập trong môi trờng lỏng bằng
phơng pháp pha loãng.
-Phân lập trên môi trờng thạch:
Mẫu tảo sau khi pha loãng đợc cấy vào đĩa thạch có chứa dinh dỡng
phù hợp với loài cần phân lập. Tảo đợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng
1500lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 18
o
C. Sau 15-20 ngày, tảo mọc
thành khuẩn lạc riêng rẽ, chọn khuẩn lạc mong muốn, dùng que cấy tách khuẩn
lạc đã chọn cho vào môi trờng lỏng, quá trình lặp lại nhiều lần cho đến khi thu
đợc tảo mong muốn (không lẫn tảo lạ)
Phân lập trong môi trờng lỏng: Tảo sau khi đã làm sạch sơ bộ, đợc pha

carbonhydrat sử dụng rất hiệu quả nhằm chống các vi khuẩn gram âm khi dùng
trực tiếp.
Tảo sau khi phân lập, làm sạch, loại bỏ vi khuẩn đợc bảo quản bằng kỹ
thuật làm bất động nhằm giữ giống lâu dài. Nguyên tắc của phơng pháp này là

10
sử dụng chất tạo gel để cố định mẫu, bảo quản mẫu ở nhiệt độ thấp, không có
ánh sáng, khi cần sử dụng hoà tan tảo và để ở điều kiện ánh sáng, nhiệt độ thích
hợp cho tảo phát triển.

dỡng cho vi tảo biển nói chung). Sau một thời gian nuôi trong môi trờng có
nồng độ muối cao, các loài tảo nhiễm tạp giảm đáng kể. Từ sinh khối tảo thu
đợc, dựa vào tốc độ ly tâm và thời gian ly tâm thích hợp cho từng loại tảo chúng
tôi tiến hành tách tảo theo phơng pháp ly tâm . Việc thí nghiệm ly tâm tách tảo
nh sau: Các chủng tảo đợc ly tâm với tốc độ khác nhau: 1000, 2000, 3000
(v/phút) trong thời gian 2 phút, 3 phút, 5 phút. Sau mỗi lần ly tâm, kiểm tra dịch
tảo và cặn tảo để xác định độ lắng, độ sạch của tảo, trạng thái tế bào tảo, từ đó
xác định tốc độ và thời gian thích hợp để làm sạch sơ bộ các chủng tảo mong
muốn. Kết quả thí nghiêm đợc thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1: Thời gian và tốc độ ly tâm thích hợp để tách tảo.
Tốc độ
Thời gian
1000v/phút 2000v/phút 3000v/phút
2 phút
Tetraselmis
chuii
Dunaliella
salina
Chlorella
vulgaris
3 phút

Isochrysis
galbana
Nannochloropsis
oculata

Kết quả cho thấy tảo Tetraselmis chuii ly tâm với tốc độ 1000vòng/phút
trong thời gian 2 phút có 80% số tế bào lắng, tảo tơng đối sạch tảo lạ, khi tăng
tốc độ ly tâm lên 2000v/phút, thời gian ly tâm 2 phút, toàn bộ 100% tế bào lắng 13 ảnh1: Đĩa thạch có khuẩn lạc dày đặc ảnh 2: Nhuộm Gram

III.2.Nghiên cứu thu tảo sạch khuẩn
Nghiên cứu ảnh hởng của kháng sinh lên việc loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo.
Để loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo chúng tôi đã thử nghiệm bổ sung một
số kháng sinh vào môi trờng nuôi cấy tảo để nghiên cứu khả năng loại bỏ vi
khuẩn của kháng sinh và ảnh hởng của chúng lên sinh trởng của tảo. Các

14
kháng sinh đợc lựa chọn phải đáp ứng yêu cầu: có khả năng loại bỏ vi khuẩn và
không làm ảnh hởng đến sinh trởng của tảo. Với mục đích trên, chúng tôi đã
thử nghiệm 4 loại kháng sinh : Tetracycline, Peflacine, Erythromycine và TA.
Thí nghiệm đợc tiến hành nh sau: chuẩn bị môi trờng thạch Gorbenko
có bổ sung kháng sinh với nồng độ khác nhau, sau đó cấy dịch tảo lên môi
trờng thạch để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và tảo. Kết quả thu đợc là cơ
sở để xác định ngỡng nồng độ kháng sinh thích hợp nhằm loại bỏ vi khuẩn đối
với từng loại tảo. Điều này rất cần thiết khi giữ giống trong môi trờng thạch.
Thí nghiệm thăm dò ảnh hởng của một số loại kháng sinh lên sinh trởng
của tảo và vi khuẩn trong dịch tảo đợc tiến hành bằng cách bổ sung trực tiếp
kháng sinh vào môi trờng nuôi cấy tảo, sau đó theo dõi sinh trởng của tảo và

(àg/ml)
T.chuii D.salina Ch.vulgaris N.oculata I.galbana
ĐC
100%
(nhiều loại
khuẩn lạc )
100% 100%

100% (nhiều
loại khuẩn
lạc)
100%
2.5
100%
(nhiều loại
khuẩn lạc )
100%, 2 loại
khuẩn lạc
100%
100%, 1 loại
khuẩn lạc
50%
5
20%, chỉ có
2 loại khuẩn
lạc.
10% 100%
20%, khuẩn
lạc bé
50%

0 100% 0 0
150
30 khuẩn
lạc phát
triển bé
0 100% 0 0

ở các đĩa thạch đợc cấy dịch tảo Chlorella lợng vi khuẩn vẫn rất nhiều,
chiếm 100% diện tích mặt đĩa thạch. Trong khi đó ở các đĩa thạch đợc cấy dịch
tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana không thấy xuất hiện vi
khuẩn. Kết quả tơng tự cũng thu đợc khi cấy dịch tảo Dunaliella lên môi
trờng thạch cứng có bổ sung peflacine nồng độ 80àg/ml .16
Từ kết quả trên có thể nhận xét rằng việc bổ sung peflacine nồng độ
20àg/ml vào môi trờng thạch đặc có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn khỏi
tảo Nannochloropsis oculata và tảo Isochrysis galbana . Đối với chủng tảo
Dunaliella salina nồng độ kháng sinh cần bổ sung là 80àg/ml , còn đối với 2
chủng tảo Tetraselmis chuii và Chlorella nồng độ kháng sinh peflacine 150ml
vẫn không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn khỏi hai chủng tảo này.
Để tìm hiểu thêm về khả năng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo Dunaliella
salina của peflacine, chúng tôi cũng đã tiến hành thử nghiệm tác dụng diệt
khuẩn của peflacine trong môi trờng lỏng nuôi tảo. Kết quả đợc trình bày ở
bảng 3.
Bảng 3: ảnh hởng của peflacine lên sinh trởng của vi khuẩn trong dịch tảo
D. salina

Nồng độ
àg/ml

150 0.110 0.217 0.331 0.422 0.566 0.603

th 1: nh hng ca Peplacine lờn sinh trng ca
D.salina
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
1 3 4 7 11 14
Thi gian thớ nghim (ngy
)
Mt (OD)
40àg/ml
80àg/ml
150àg/ml

Đối với các giống tảo Tetraselmis chuii và Chlorella vulgaris, sử dụng
peflacine với nồng độ từ 2.5àg/ml -150àg/ml trong môi trờng thạch đặc không
có hiệu quả loại bỏ vi khuẩn. Trong lúc đó đối với tảo Nannochloropsis oculata ,
việc bổ sung peflacine vào môi trờng thạch đặc ở nồng độ 20àg/ml cho kết quả
tốt, loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn (bảng 2). Tuy nhiên khi nuôi cấy tảo này trong
môi trờng lỏng nồng độ kháng sinh bao nhiêu là phù hợp và peflacine ảnh
hởng nh thế nào đến sinh trởng của tảo? Để làm rõ hơn câu hỏi trên chúng tôi
đã tiếp tục thử nghiệm bổ sung peflacine vào dịch tảo Nannochloropsis oculata
để theo dõi. Kết quả thí nghiệm đợc trình bày ở bảng 5 và bảng 6.


20 0.083 0.139 0.252 0.312 0.439
40 0.083 0.134 0.237 0.316 0.437

19
Đối với tảo Isochrysis galbana, bổ sung peflacine vào môi trờng thạch
cứng nồng độ từ 20àg/ml -150àg/ml có tác dụng loại bỏ hết vi khuẩn(bảng 2).
Tuy nhiên khi bổ sung kháng sinh này vào môi trờng lỏng nuôi tảo với nồng độ
từ 20-150àg/ml không có khả năng loại bỏ hết vi khuẩn trong dịch tảo(bảng 7).
Bảng 7: ảnh hởng của peflacine lên sinh trởng của
vi khuẩn trong dịch tảo I. galbana
Nồng độ KS
àg/ml
Thời gian TN
20 40 80 150
15 ngày
nhiều khuẩn
lạc
nhiều khuẩn
lạc
nhiều khuẩn
lạc
nhiều khuẩn
lạc

Mặt khác, khi tăng nồng độ kháng sinh peflacine lên 80àg/ml đã có ảnh
hởng xấu lên sinh trởng của tảo (bảng 8). Vì vậy việc sử dụng peflacine để bổ
sung vào dịch tảo Isochrysis galbana là không thích hợp.

Bảng 8: ảnh hởng của peflacine lên sinh trởng của tảo I.galbana


Nồng độ
(àg/ml)
3 6 9
DC 100% 100% 100%
2.5 100% 100% 100%
5 100% 50% 40%
10 20% 20% 20%
20 10% 5% 5%
40 5% 2.5% 2% Kết quả ở bảng 9 cho thấy lợng vi khuẩn trong dịch tảo tuy có giảm
nhiều so với công thức đối chứng tuy nhiên với nồng độ peflacine từ 2.5àg/ml -
40àg/ml vẫn không có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn. Chúng tôi tiếp tục
nâng nồng độ kháng sinh lên 200-400àg/ml . Kết quả đợc trình bày ở bảng 10
cho thấy khi nồng độ peflacine trong môi trờng nuôi tảo đạt 400àg/ml vẫn
không có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn trong dịch tảo. Tuy nhiên nồng độ
kháng sinh peflacine từ 2.5-40àg/ml với thời gian xử lí ngắn (3-6 ngày) không
có ảnh hởng nhiều đến sinh trởng của tảo (bảng 11, 12).
Bảng 10: ảnh hởng của peflacine lên sinh trởng của vi khuẩn trong dịch tảo
Ch. vulgaris Nồng độ
àg/ml

Thời gian
200 300 400
15 ngày nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc


400

0.089 0.177 0.245 0.327 0.401 0.445 Chúng tôi cũng đã thử nghiệm sử dụng peflacine để bổ sung vào dịch tảo
Tetraselimis chuii, kết quả cho thấy đối với tảo Tetraselmis chuii, nồng độ
peflacine từ 50-200àg/ml không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo.
Việc bổ sung peflacine vào môi trờng thạch với nồng độ lên đến 300àg/ml
cũng không có kết quả.Vì vậy chúng tôi không tiếp tục thử nghiệm sử dụng
peflacine đối với tảo Tetraselmis chuii.
Từ những kết quả thu đợc ở trên cho thấy: có thể sử dụng peflacine
nồng độ 20
à
g/ml -40
à
g/ml bổ sung vào môi trờng thạch để giữ giống các