

 


!"#!
!
$%&#'
$&(

)*+, /0-123/44
 
MỤC LỤC
Trang 2
 
4$5&67!!89
4 +:-+;-<+=>+?2@-AB2@<@CC:CDE@*+F
a. Thực hành.
- Cân 5 g CPE cho vào cốc và tách bằng nước với tỉ lệ là 1:5, tức 5 g + 25
ml nước cất.
- Khuấy đều trong thời gian 30 phút.
- Lọc lấy dịch chiết và được thể tích là 21 ml.
- Tủa bằng cồn lạnh với tỷ lệ 1:3, tức 21 ml dịch chiết + 63 ml cồn lạnh.
- Cho hỗn hợp dung dịch trên vào bình erlen và giữ lạnh 30 phút.
- Tách lấy phần tủa ở phần dưới bình với thể tích là 25 ml và cho vào ống ly
tâm 50 ml.
- Đem cân phân tích được 33.4 g.
- Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút.
- Tách lấy protein tủa, giữ lạnh để xác định hàm lượng protein và hoạt tính
enzyme trước sắc ký.
b. Kết quả.

V(ml) albumin 0 1 1 1 1 1
H
2
O (ml) 1 0 0 0 0 0
Thuốc thử Coomassie 2 2 2 2 2 2
c. Kết quả.
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ phải sang trái ta thấy: ống đối chứng có
màu xanh nhạt nhất, và các ống thí nghiệm từ ống số 1 đến ống số 5 có màu xanh
đậm dần như hình 3.
Hình 3: Kết quả so màu.
• Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm:
Trang 5
 
Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5
OD 0 0.088 0.131 0.161 0.188 0.209
• Dựng đường protein chuẩn.
Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm, ta dựng được đường
protein chuẩn như sau:
d. Nhận xét kết
quả:
• Dựa
vào kết
quả so
màu ta
thấy, nồng độ albumin càng cao thì màu xanh càng đậm.
• Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì
chỉ số OD càng cao.
3. G HIJ <+:?-<MNHIJ .C:<DE@.
a. Thực hành.
• Hóa chất

nhiệt độ phòng bằng chậu nước lạnh. Đặt độ hấp thụ của ống đối chứng ở bước
sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm và
ghi lại kết quả.
Trang 7
 
c. Kết quả:
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có
màu vàng, các ống thí nghiệm có màu đỏ và đậm dần từ ống thí nghiệm số 1 đến
ống thí nghiệm số 5 như hình 4.
Hình 4: Kết quả so màu.
• Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm
Ống số ĐC 1 2 3 4 5
OD 0 0.149 0.253 0.392 0.504 0.675
• Dựng đường chuẩn đường glucose
Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) đo ở bước sóng 540 nm, ta dựng được
đường chuẩn đường glucose như sau:
Trang 8
 
d. Nhận xét kết quả:
• Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời
thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì màu đỏ càng
đậm.
• Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ đường glucose càng
cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì
chỉ số OD càng cao.
Trang 9
 
OL3$#'PQR(S!"#!
4 Q-++IT UTL-+LV*HWH=-+DX**Y-+<MN@-AB2@Z[/
/

trong chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
• Ống nghiệm không có phản ứng enzyme
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để
bất hoạt enzyme.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc
đều.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
• 5 ống nghiệm có phản ứng enzyme, được đánh số từ 1 đến 5.
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 1 và ủ ở nhiệt độ
phòng (30
0
C) trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch
CMC pH
5
thích hợp ở nhiệt độ phòng.
Trang 10
 
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 2 và ủ ở nhiệt độ
40
0
C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC
pH
5
thích hợp ở nhiệt độ 40
0
C.

enzyme trên và lắc đều.
- Để phản ứng ở nhiệt độ thích hợp chính xác 10 phút.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều để ngừng phản ứng
enzyme.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong
một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
c. Kết quả
- Quan sát bằng mắt thường, từ phải sang trái theo thứ tự lần lượt là: ống đối
chứng và ống không phản ứng có màu vàng, từ ống thí nghiệm số 1 ở 30
0
C
đến ống nghiệm số 4 ở 60
0
C màu đỏ đậm dần, và ống nghiệm số 5 ở 70
0
C
màu đỏ nhạt dần như hình 5.
Hình 5: Kết quả so màu.
Trang 11
 
- Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm là:
Số ống ĐC KPƯ
30
0
C 40
0
C 50
0
C 60
0

OD
70
= 1.285
Thế vào phương trình: y = 1.303x + 0.003 ta được:
X
30
Tương tự cách tính trên ta được:
X
40
= 0.92
X
50
= 0.87
X
60
= 1.023
X
70
= 0.98
Mặt khác ta có phương trình :
U= ( A
t
– A
0
)*F *
Thế x vào phương trình U ta được:
Trang 12
 
U
30

phân. Vì vậy hiệu suất thủy phân giảm.
- Ở nhiệt độ 70
0
C thì enzyme dần dần bị biến tính nên hiệu suất thủy
phân giảm dần.
g. Đánh giá kết quả:
Dựa vào kết quả so màu ta thấy:
Trang 13
 
- Mẫu đối chứng có màu vàng là màu của thuốc thử DNS pha loãng với
1ml nước cất.
- Ống không phản ứng có màu vàng đậm, chứng tỏ ở đây hoạt tính
enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme
và dung dịch CMC pH
5
.
- Ống có phản ứng với enzyme từ nhiệt độ 30, 40 và 50
0
c có màu đỏ
đậm dần theo thứ tự từ nhiệt độ 30, 40 đến 50
0
C. Chứng tỏ nhiệt độ
tăng dần từ 30, 40 đến 50
0
C thì hoạt tính enzyme tăng dần.
- Ở nhiệt độ 60
0
C màu đỏ đậm nhất, chứng tỏ ở nhiệt độ này hoạt tính
enzyme hoạt động mạnh nhất. Enzyme thủy phân dung dịch CMC
càng mạnh làm cho màu của dung dịch có màu đỏ đậm.

3
vào ống nghiệm số 1 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
4
vào ống nghiệm số 2 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm số 3 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
6
vào ống nghiệm số 4 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
7
vào ống nghiệm số 5 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
8
vào ống nghiệm số 6 và lắc đều.
- Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh
đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng
540 nm.
• 6 ống phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6.
- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 40
0
C
trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch: CMC pH
3
,
CMC pH
4
, CMC pH

đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
8
vào ống nghiệm 6 chứa enzyme và lắc
đều.
- Để phản ứng ở 40
0
C chính xác 10 phút.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose vào 6 ống nghiệm và lắc đều để
ngừng phản ứng enzyme.
Trang 15
 
- Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh
đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước
sóng 540 nm.
c. Kết quả:
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có
màu vàng và 6 ống nghiệm không phản ứng với enzyme, từ ống số 1 đến ống số
2 có màu vàng đậm dần. Từ ống số 3 đến ống số 6 màu vàng nhạt dần như hình
6.
Hình 6: Kết quả so màu của ống ĐC và 6 ống nghiệm không phản ứng.
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có
màu vàng và 6 ống nghiệm có phản ứng với enzyme có màu đỏ. Từ ống số 1 ở
Trang 16
 
pH
3
đến ống số 2 ở pH
4


1
= 0.486
- Tại pH=4: ∆OD= 0.958 – 0.394 =0.564
X
2
= 0.564
- Tại pH=5: ∆OD= 0.837- 0.398 =0.439
X
3
=0.492
- Tại pH = 6: ∆OD = 0.641-0.398=0.243
X
4
=0.3012
- Tại pH = 7: ∆OD = 0.382-0.372=0.01
X
5
=0.21
-Tại pH = 8: ∆OD = 0.517-0.391= 0.126
X
6
=0.126
Trang 17
 
Từ đó ta tính được:
U
1
=81
U
2

• Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0.
- Hút 1 ml nước cất cho vào ống nghiệm.
Trang 18
 
- Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie.
- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
• Ống thực nghiệm: phản ứng enzyme.
- Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm.
- Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie.
- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
c. Kết quả:
- Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang ta thấy, ống đối
chứng có màu xanh nhạt và ống thực nghiệm có màu xanh như ở hình
8.
Hình 8: Kết quả so màu
- Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có OD = 0.25
d. Tính toán kết quả thu được:
Đường chuẩn protein có dạng y = Ax + B
Ta có đường chuẩn protein là: y = 0.003x + 0.0657
Ta lại có: OD = 0.25
Trang 19
 
Suy ra: x = = 61.4 ( µg/ml )
Vì được pha loãng 100 lần nên:
x = 61.4 (µg/ml)* 100 * 10 (ml) = 61400 ( µg ) = 61.4 (mg)
Vậy tổng hàm lượng protein là: = 61.4 (mg)
0 5,<H`-++DX**Y-+@-AB2@*KIa<Eb<cd
i. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi
enzyme carboxymethyl cellulose ở pH

đều.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong một cốc nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm.
• Ống nghiệm có phản ứng enzyme.
- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 40
0
C
trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH
5

thích hợp ở 40
0
C trong 10 phút.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc
đều.
- Để phản ứng ở 40
0
C chính xác 10 phút.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều để ngừng phản ứng
enzyme.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong một cốc nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
iii. Kết quả:
- Quan sát bằng mắt thường ta thấy: ống đối chứng có màu vàng là màu
của dung dịch DNS-lastose pha loãng với 1 ml nước cất. Ống không
có phản ứng có màu vàng là màu vàng của DNS-lastose, chứng tỏ ở
đây enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa
enzyme và dung dịch CMC pH

Thay vào phương trình ta có:
x = = 1.15
Thế vào phương trình u ta được:
U = 1.15 * 0.75 * * * * 100 * 10 = 645.8
Vậy tổng hoạt tính của enzyme là: = 645.8
Ta có hoạt tính riêng là:
Hoạt tính riêng = = = 10.52
Trang 23
 
Trang 24
 
OL[$ ef6!6 !5gh/
4 Ia<Hi:*L-+EX<+@-AB2@<@CC:CDE@Uj Eb<cdCk<.@C
a. Nguyên tắc
Kỷ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước,
trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel.
Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ
bị trì hoãn và di chuyển chaamjqua cột, trong khi những phân tử
lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và
được giải hấp ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
b. Thực hành
• Dụng cụ và thiết bị
- Phễu đổ gel
- Bình hút chân không
- Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30*1.5 cm, thể tích: 53 ml.
- Bình đựng dung dịch đệm
- Ống nghiệm 20 cái vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung
dịch.
• Hóa chất
- Gel “Sephadex G-100”.