BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
HOÀNG ĐỨC CHIẾN
TỔNG HỢP VÀ TẠO DÕNG PHÂN TỬ
GEN INTERFERON ALPHA 2A Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006 Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006
iii
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***
SYNTHESIZE AND CLONE MOLECULE
GEN INTERFERON ALPHA 2A Graduation thesis
Major: Biotechnology
tốt nghiệp.
v TÓM TẮT KHÓA LUẬN
HOÀNG ĐỨC CHIẾN, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006, “TỔNG
HỢP VÀ TẠO DÒNG PHÂN TỬ GEN INTERFERON ALPHA 2A ”.
Hƣớng dẫn khoa học:
ThS. Trần Quỳnh Hoa
Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06-02-2006 đến ngày 31-07-2005 tại phòng thí
nghiệm sinh học phân tử của công ty NTL Biotech.
Ở nƣớc ta hiện nay việc sử dụng interferon trong chữa trị các bệnh nhƣ ung thƣ,
các bệnh do virus gây ra đã phổ biến. Nhƣng những interferon này chủ yếu đƣợc sản
1.2. Mục đích - yêu cầu 1
1.2.1. Mục đích 1
1.2.2. Yêu cầu 1
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lƣợc về interferon 2
2.1.1. Đặc điểm chung của interferon 2
2.1.2. Đặc điểm interferon alpha 2a 3
2.1.3. Tình hình nghiên cứu 3
2.2. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 3
2.2.1. Giới thiệu về phản ứng PCR 3
2.2.2. Một số yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 4
2.2.2.1. Enzyme DNA polymerase 4
2.2.2.2. Các nucleotide tự do (dNTPs) 4
2.2.2.3. Primer và nhiệt độ lai 5
2.2.2.4. DNA khuôn 5
2.2.2.5. Dung dịch đệm 5
2.2.2.6. Số chu kỳ phản ứng 6
2.2.2.7. Nhiệt độ và pH 6
2.2.3. Tổng hợp gen 6
2.2.4. Ứng dụng của PCR 6
vii
2.3. Kỹ thuật điện di DNA 7
2.4. Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 7
2.4.1. Hiện tƣợng biến nạp 7
2.4.2. Vector – công cụ biến nạp 7
2.4.2.1. Plasmid 8
2.4.2.2. Phage 9
2.4.3. Biến nạp nhân tạo ở vi khuẩn 10
3.3.5. Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn 23
3.3.6. Quy trình tách plasmid 23
3.3.7. Chạy PCR kiểm tra 23
3.3.8. Thực hiện phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn 24
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
4.1. Phản ứng tổng hợp IFN-α2a 25
4.2. Tạo dòng phân tử IFN-α2a 26
4.2.1. Kết quả biến nạp 26
4.2.2. Tách plasmid 26
4.3. Kết quả kiểm tra 27
4.3.1. Kiểm tra PCR 27
4.3.2. Cắt bằng enzyme cắt giới hạn 28
4.4. Kết quả giải trình tự 28
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30
5.1. Kết luận 30
5.2. Đề nghị 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
PHỤ LỤC 33
ix
X-gal 5-bromo-4 chloro-3 indolyl-β-D galactopyranoside
x DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Cấu trúc 3D của interferon 2
Hình 2.2: Các chu kỳ phản ứng PCR 4
Hình 2.3: Mô hình plasmid sử dụng cho cloning 8
Hình 2.4: Cấu trúc của phage T4 9
Hình 2.5: Cấu trúc của operon lac 11
Hình 3.1: Vector pGEM-T 17
Hình 3.2: Mô hình nối gen chèn vào vector T 22
Hình 4.1: Kết quả tổng hợp gen 25
Hình 4.2: Kết quả cấy vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc 26
Hình 4.3: Kết quả điện di plasmid trên gel agarose 1% 27
Hình 4.4: Kết quả PCR kiểm tra 27
Hình 4.5: Kiểm tra bằng enzyme cắt 28
Hình 4.6: Trình tự đoạn gen IFN- 2a tổng hợp đƣợc 28
Hình 4.7: Kết quả so sánh trình tự acid amin 29
Tạo dòng đƣợc đoạn gen IFN-α2a: gắn gen IFN-α2a vào vector pGEM-T sau đó
chuyển vào vi khuẩn E. coli. 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. SƠ LƢỢC VỀ INTERFERON
2.1.1. Đặc điểm chung của interferon
Vào năm 1957, Isaacs và Lindenmann đã phát hiện ra interferon trong khi nghiên
cứu các chất có hoạt tính ngăn cản sự nhân lên của các siêu vi ở các tế bào mới bị
nhiễm. Ngày nay ngƣời ta đã biết interferon là một gia đình có nhiều loại phân tử khác
nhau không những có tác dụng ngăn cản sự nhân lên của các siêu vi mà còn ngăn cản
sự tăng sinh của một số tế bào (kể cả tế bào ung thƣ) và điều biến đáp ứng miễn dịch. Hình 2.1: Cấu trúc 3D của interferon
Căn cứ vào các đặc điểm tổng quát ngƣời ta chia interferon làm 2 loại là interferon
type I và interferon type II. Interferon type I chủ yếu có hoạt tính chống siêu vi, hầu
hết tế bào đều có thể sản xuất ra interferon type I khi bị nhiễm bởi siêu vi, vi khuẩn
hay các nguyên sinh động vật. Interferon type I có hai dạng chính là IFN α và IFN β.
- IFN α là nhóm IFN đƣợc tiết chủ yếu từ bạch cầu, tối thiểu có khoảng 14
loại thuộc nhóm này, chúng có cấu trúc của chuỗi acid amin tƣơng đồng với nhau đến
90 %. IFN α trong điều trị nhiễm siêu vi viêm gan B và C có thể ngăn cản đƣợc tình
trạng tăng sinh của siêu vi và sự tiến triển của bệnh khoảng 40 %. Một số bệnh ung thƣ
nhƣ ung thƣ tế bào hắc tố, ung thƣ xƣơng, ung thƣ tƣơng bào… cũng đã đƣợc thử
3
thuyết, phƣơng pháp này có ba acid nucleic: một DNA dây đôi cần đƣợc khuếch đại,
hai sợi đóng vai trò mồi (primer) với kích thƣớc rất ngắn chạy theo chiều thuận và
4 nghịch trên DNA nền, thêm vào là DNA polymerase, dNTPs và một muối Mg
(M.J. McPherson và S.G. Moller, 2000).
Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau:
- Bƣớc 1: Tạo dây đơn DNA nhờ hiện tƣợng biến chất (denature) thƣờng ở
nhiệt độ 94 – 95
o
C
- Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy
thuộc vào trình tự của primer, thông thƣờng khoảng 40 – 60
o
C.
- Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc thực hiện ở 72
o
C. Hình 2.2: Các chu kỳ phản ứng PCR
2.2.2. Một số yếu tố tham gia vào phản ứng PCR
2.2.2.1. Enzyme DNA polymerase
Enzyme đƣợc sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I Đây là
enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Phƣơng pháp PCR
trở nên thuận lợi hơn với việc phát hiện ra enzyme DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc
tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus hiện diện trong suối nƣớc nóng, viết tắt là Taq
polymerase, enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính
DNA khoảng 94
Kết quả phản ứng PCR phụ thuộc rất lớn vào độ tinh sạch cũng nhƣ lƣợng DNA
mẫu. Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực
tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu…. Lƣợng DNA mẫu thƣờng đƣợc sử dụng là
100 ng. Lƣợng mẫu phù hợp có tác dụng hạn chế sự khuếch đại tạo các sản phẩm
không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).
2.2.2.5. Dung dịch đệm
Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là Mg
2+
. Nó rất cần thiết cho
quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho hầu hết các enzyme DNA polymerase. Nồng
độ tối ƣu của Mg
2+
là 1,5 mM. Nồng độ Mg
2+
quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản
ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg
2+
quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản
phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg
2+
dẫn đến sự
bắt cặp sai giữa primer và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu
(Huỳnh Thùy Hồ Dƣơng, 1998).
6 2.2.2.6. Số chu kỳ phản ứng
Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế thƣờng không vƣợt quá 40 chu kỳ.
Số chu kỳ tùy thuộc vào lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu số chu kỳ ít thì lƣợng DNA
- Trong thực phẩm: sử dụng để xem thực phẩm có sử dụng sản phẩm chuyển
gen hay không, xác định nguyên nhân gây bệnh trong mẫu thực phẩm là do virus hay
vi khuẩn.
- PCR còn đƣợc sử dụng để nhân nhanh những đoạn gen quý hiếm và còn
đƣợc sử dụng trong tổng hợp gen.
7 - Gần đây nhất là sự đóng góp thiết thực của kỹ thuật PCR trong việc giải
mã bộ gen ngƣời.
2.3. KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA
Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cho phép xác định kích thƣớc đoạn DNA. DNA sẽ
đƣợc đi qua chất nền đƣợc gọi là gel trong một điện trƣờng. DNA tích điện âm cho
nên trong điện di mẫu đƣợc cho vào những giếng gần cực điện âm và DNA sẽ di
chuyển về phía cực dƣơng. Sự di chuyển tỷ lệ nghịch với kích thƣớc phân tử, những
phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh và ngƣợc lại.
Trong điện di ngƣời ta thƣờng sử dụng gel làm từ các vật liệu: agarose,
acrylamide… Agarose là một trong các dạng của polysaccharide, chúng sẽ tạo thành
hạt sau khi tan ở nhiệt độ cao. Khi nguội lại những hạt agarose này sẽ kết tụ lại với
nhau. Giữa những hạt nhƣ vậy có những lỗ rất nhỏ. Kích thƣớc của những lỗ này có
thể xê dịch chút ít tùy theo nồng độ của agarose. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của
agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự
dịch chuyển này của DNA.
Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân
tử. Ngƣời ta có thể quan sát chúng bằng mắt, nhờ kỹ thuật nhuộm màu DNA với
ethidium bromide và chiếu dƣới tia cực tím.
2.4. HIỆN TƢỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN
2.4.1. Hiện tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp đã đƣợc chứng minh lần đầu tiên năm 1928 trên vi khuẩn
streptococcus pneumoniae bởi Fred Griffiths và đến năm 1944 đã đƣợc kiểm chứng lại
Hình 2.3: Mô hình plasmid sử dụng cho cloning
(Nguồn tài liệu T.A. Brown, 1997)
Cấu trúc của plasmid bao gồm vùng ori giúp quá trình nhân nhanh về số lƣợng
nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ. Những plasmid nhỏ có
thể sử dụng DNA của tế bào kí chủ cho việc nhân bản của nó, nhƣng đối với plasmid
9 lớn chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho quá trình tái bản của chính
nó. Tuy nhiên một vài plasmid gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lƣợng
plasmid đƣợc nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Những plasmid hợp
nhất gọi là episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kỳ phân chia tế bào, nhƣng trong
một giai đoạn nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do. Phân loại plasmid dựa vào
đặc tính cơ bản mã hóa bởi gen của nó. Đƣợc chia làm 5 loại:
- Fertility plasmid chỉ mang tra gen có khả năng chuyển vị và tiếp hợp.
- R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp chất kháng lại chất kháng
sinh giúp tế bào chủ tồn tại trong môi trƣờng sống.
- Col plasmid tạo ra colycin gây chết vi khuẩn khác.
- Degradative plasmid giúp kí chủ tạo các chất sinh học có tính chất đặc biệt
trong điều nào đó nhƣ toluen, acid salycylyc.
- Virulence plasmid xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ (Nguyễn
Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
2.4.2.2 Phage
Phages hay bacteriophages xem nhƣ phổ biến tiêm vào vi khuẩn, giống nhƣ tất cả
virus, phage là cấu trúc đơn giản bao gồm phần đầu mang nhiều phân tử DNA chứa
nhiều gen, phần đuôi xung quanh là lớp bọc tạo thành khối phân tử protein. Khi tấn
công DNA của phage đƣợc truyền vào tế bào chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân
nhanh về số lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA
vào tế bào.
bằng lactose (β–galactisido–glucose), E. coli ngừng tăng trƣởng và hồi phục sau đó
nhờ tổng hợp đƣợc 3 enzyme:
- Permerase kích thích sự thấm lactose
- Acetylase (vai trò chƣa rõ)
- β–galactosidase xúc tác sự thủy giải lactose thành galactose và glucose
Ba enzyme này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose,
chúng đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này
11 qua mô hình hoạt động của operon lac (lactose operon). Operon lac là đoạn DNA
chứa: ba gen cấu trúc lac Z (mã hoá β–galactosidase), lac Y (mã hóa permerase) và lac
A (mã hóa acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P),
đánh dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator
(vùng hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzyme. Operator quyết
địmh RNA polymerase không liên kết hay liên kết với promoter và di chuyển dọc theo
các gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).
Hình 2.5: Cấu trúc của operon lac.
Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng liên hệ cùng với promoter và
operator là operon. Operon chỉ có ở prokaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp
các gen liên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc
kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon
lac Z là gen điều hoà I, gen này mã hóa repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự
biểu hiện gen (I có promoter riêng) để tạo ra repressor. Repressor nhận biết và liên kết
với operator, cản sự liên kết của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và
không có glucose), lactose liên kết với repressor và làm biến đổi hình thể của
repressor, do đó repressor không liên kết với operator, operon lac mở, RNA
polymerase liên kết với promoter và trƣợt dài theo các gen của operon, mRNA (mã
hóa cho cả 3 enzyme) đƣợc tạo thành và đƣợc dịch mã thành các polypeptide riêng
- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai
khuẩn lạc.
- Sử dụng enzyme cắt plasmid để xác định sự hiện diện của gen chèn.
- Sử dụng phƣơng pháp α-complementation. Nhiều plasmid mang một đoạn
ngắn DNA của E. coli chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của
β-galactosidase. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với chủng E. coli thể hiện phần
đầu carboxyl của β-galactosidase. Nếu là trƣờng hợp vector – vector thì sản phẩm của
gen lac I không thể kết dính với vùng hoạt động của promoter – operator của gen
lac Z’, cho nên gen lac Z’ trong plasmid đƣợc chuyển mã và giải mã. Protein lac Z’
phối hợp với protein đã đƣợc mang tín hiệu di truyền của DNA nhiễm sắc thể
để tạo ra một galactosidase lai. Cuối cùng thì 5-bromo-4 chloro-3 indolyl-β-D
galactopyranoside (X-gal) trong môi trƣờng sẽ bị thủy phân bởi galactosidase lai này,
13 cho ra một sản phẩm màu xanh. Trong điều kiện nhƣ vậy thì khuẩn lạc có chứa thể
vector – vector sẽ có màu xanh. Ngƣợc lại, những khuẩn lạc mang thể vector – DNA
chèn sẽ có màu trắng bởi vì DNA đƣợc chèn vào vị trí restriction endonuclease.Trong
nhiều chuỗi mã của dòng sẽ đột phá khả năng đọc của gen lac Z’ và ngăn cản việc sản
xuất protein lac Z’ chức năng, tạo ra hệ quả là không có một galactosidase lai nào
đƣợc sản xuất. Sự vắng mặt của galactosidase lai làm cho X-gal trong môi trƣờng
không đƣợc chuyển đổi thành hợp chất màu xanh. Để có sự biểu hiện của
β-galactosidase cần có chất kích hoạt isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG).
2.4.4. Vai trò và ứng dụng
Hiện tƣợng biến nạp giúp cho vi khuẩn có thêm các tính trạng mới để dễ thích
nghi với môi trƣờng mới. Đồng thời đây cũng là cơ sở của sự tiến hóa.
Biến nạp là bƣớc đầu trong kỹ thuật cloning. Vi sinh vật đƣợc xem nhƣ là một cỗ
máy sản xuất phục vụ nhu cầu con ngƣời. Ngày càng có nhiều những sản phẩm đƣợc
sản xuất từ những vi sinh vật chuyển gen nhƣ: các kháng sinh, các kháng thể, các loại
protein…
với cơ chất.
Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp
nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp
xếp khác nhau). Trƣờng hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm
bốn cặp nucleotide, cứ 4
4
= 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt. Khi các enzyme giới
hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 4
6
= 4096 cặp nucleotide
có một chỗ bị cắt. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA ở
những vị trí nhất định. Có hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu
dính.
Enzyme giới hạn cắt cả 2 mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng
(blunt ends). Các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại
với nhau. Để nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzyme nối DNA ligase, hoặc
các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme.
Ví dụ: Enzyme Sma I cắt tạo đầu bằng giữa các đoạn 6 bp
5’ … CCCGGG … 3’
3’ … GGGCCC … 5’
5’ … CCC ~ OH + P ~ GGG … 3’
3’ … GGG ~ P OH ~ CCC … 5’
Nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa
hai mạch đơn, tạo nên các đầu dính (cohesive ends). Các đầu dính tạo nên sau khi cắt
có thể tự nối lại với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase, nhờ đặc
15
nhầm lẫn do kỹ thuật. Cả hai loại primer xuôi và ngƣợc đều đƣợc sử dụng để đọc cả
hai mạch đơn DNA.
Giải trình tự theo phƣơng pháp tự động không phải dùng chất phóng xạ mà sử
dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát hiện cùng
một lúc hiện tƣợng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999).
Nde I
Copyright: Tài liệu đại học ©