1

Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật
Nguyễn Hoàng Lộc
Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế

1. Các hợp chất thứ cấp thực vật
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm
có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình
thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ.
Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là
sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ
cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002).
Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên
tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein,
nicotine, caffeine và morphine. Một số loài thực vậ
- - (họ
Solanaceae). Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần
giống nhau. Đôi khi toàn câ
- -
(họ
Taxaceae).
dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin ), một số khác tác dụng
dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994).
Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung
môi. Giống như những
, ví dụ monoterpene
chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị
isoprene (Lee 2001).
Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic

Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) có ưu điểm
là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé
nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn
dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ
xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù
thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự
với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng.

3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật
Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp
nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa
về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị
có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công
nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995). Kỹ thuật nuôi cấy tế
bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để
nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu
cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp
sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: (1) tổng hợp các hợp
chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với
khí hậu và điều kiện đất trồng; (2) phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất
thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng); (3) có thể chọn lọc các giống cây trồng cho
nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; (4) với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của
3

tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên
cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật
cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999).
Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều
kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu
được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác

Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp
trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ
thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ
máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm
hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học
và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các
4

hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất
cao (DiCosmo và Tallevi, 1985).

4. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học
Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính
toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng
các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa.
Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề
đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của
điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn
để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công
nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực
vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này. Bảng 2 giới
thiệu sản phẩm của một số cây dược liệu quan trọng đã được sản xuất từ nuôi cấy callus và tế
bào huyền phù (Mulbagal and Tsay 2004).
Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả
năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm
1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử
nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng
taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có
tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác
(Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm

Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai
trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ
tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung
vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày
nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng
hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi
phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần.
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ
của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn
tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato
(1981) C. japonica. Sau
đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10
-8
M
gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa
1994).
Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử
dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn
tiêu hóa, bệnh đái đường,
sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích
thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô callus P. ginseng để phân lập saponins và
sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công
nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung
nghiên cứu nhiều nhất.
Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách
gây nhiễm chủng A
4
của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một
spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm
lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ

sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân
tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô).
Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus
tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường
có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003).
chi thuộc họ Solanaceae
như: Duboisia, Scopolia, Atropa, Hyoscyamus và Datura.
những
năm 1960 (Misawa, 1994). Tuy nhiên, hàm lượng của scopolamine và hyoscyamine trong tế
bào nuôi cấy thường rất thấp. Sau này, Tabata và cs (1971) đã bổ sung tropic acid vào dịch
huyền phù nuôi cấy Scopolia japonica
lên 15 lần.
Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây Lithospermum
erythrorhizon . Tuy nhiên, người ta đã tạo
được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn
chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ
nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin.
Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây
Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn
xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984).
Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung
cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuôi
cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm
1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcohol
7

và b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ
sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo
khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035%
podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium

Ailanthus altissima
Alkaloids
Huyền phù
Anderson và cs 1987
Ailanthus altissima
Canthinone alkaloids
Huyền phù
Anderson và cs 1986
Allium sativum
Alliin
Callus
Malpathak và David 1986
Aloe saponaria
Tetrahydroanthracene
glucosides
Huyền phù
Yagi và cs 1983
Ambrosia tenuifolia
Altamisine
Callus
Goleniowski và Trippi
1999
Anchusa officinalis
Rosmarinic alkaloids
Huyền phù
De-Eknamkul và Ellis
1985
Brucea javanica
Canthinone alkaloids
Huyền phù

Huyền phù
Zhao và cs 2001
Choisya ternata
Furoquinoline alkaloids
Huyền phù
Sejourne và cs 1981
Chrysanthemum
cinerariaefolium
Pyrethrins
Callus
Rajasekaran và cs 1991
Chrysanthemum
cinerariaefolium
Chrysanthemic acid và
pyrethrins
Huyền phù
Kuel và cs 1985
Cinchona L.
Alkaloids
Huyền phù
Koblitz và cs 1983
Cinchona robusta
Robustaquinones
Huyền phù
Schripsema và cs 1999
Cinchona sp.
Anthraquinones
Huyền phù
Wijnsma và cs 1985
Cinchona succirubra

Callus
Venkateswara và cs 1987
Digitalis purpurea
Cardenolides
Huyền phù
Hagimori và cs 1982
Dioscorea deltoidea
Diosgenin
Huyền phù
Heble và Staba 1980
Dioscorea doryophora
Diosgenin
Huyền phù
Huang và cs 1993
Duboisia leichhardtii
Tropane alkaloids
Callus
Yamada và Endo 1984
Ephedra spp.
L-Ephedrine, D-
pseudoephedrin
Huyền phù
O’Dowd và cs 1993
Eriobotrya japonica
Triterpenes
Callus
Taniguchi và cs 2002
Eucalyptus tereticornis
Sterol và hợp chất
phenolic

Triterpenes
Callus
Ayabe và cs 1990
Hyoscyamus niger
Tropane alkaloids
Callus
Yamada và Hashimoto
1982
Isoplexis isabellina
Anthraquinones
Huyền phù
Arrebola và cs 1999
Linum flavum
5-Methoxypodophyllo-
toxin
Huyền phù
Uden và cs 1990
Lithospermum erythrorhizon
Dẫn xuất của shikonin
Huyền phù
Fujita và cs 1981
Lithospermum erythrorhizon
Dẫn xuất của shikonin
Huyền phù
Fujita và cs 1990
Lycium chinense
Cerebroside
Huyền phù
Jang và cs 1998
Morinda citrifolia

Thergane và cs 2003
Ophiorrhiza pumila
Camptothecin dạng
alkaloids
Callus
Kitajima và cs 1998
Panax ginseng
Saponins và sapogenins
Callus
Furuya và cs 1973
Panax notoginseng
Ginsenosides
Huyền phù
Zhong và Zhu 1995
Papaver bracteatum
Thebaine
Callus
Day và cs 1986
Papaver somniferum
Morphine, Codeine
Huyền phù
Siah và Doran 1991
Peganum harmala
Β-Carboline alkaloids
Huyền phù
Sasse và cs 1982
Phytolacca americana
Betacyanin
Huyền phù
Sakuta và cs 1987

Rauwolfia sellowii
Alkaloids
Huyền phù
Rech và cs 1998
Rauwolfia serpentina
Reserpine
Huyền phù
Yamamoto và Yamada,
1986
R. serpentina × Rhazya
stricta
3-Oxo-rhazinilam
Callus
Gerasimenko và cs 2001
Ruta sp.
Acridone, furoquinoline
alkaloids và coumarins
Callus
Baumert và cs 1992
Salvia fruticosa
Rosmarinic acid
Callus và
huyền phù
Karam và cs 2003
Salvia miltiorrhiza
Lithospermic acid B và
rosmarinic acid
Callus
Morimoto và cs 1994
Salvia miltiorrhiza

L-DOPA
Huyền phù
Huang và cs 2002
Tabernaemontana
divaricata
Alkaloids
Huyền phù
Sierra và cs 1992
Taxus spp.
Taxol
Huyền phù
Wu và cs 2001
Taxus baccata
Taxol, baccatin III
Huyền phù
Cusido và cs 1999
Taxus cuspidata
Taxoids
Huyền phù
Ketchum và cs 2003
Tecoma sambucifolium
Phenylpropanoid
glycosides
Callus
Pletsch và cs 1993
11

Thalictrum minus
Berberin
Huyền phù

175.
7. Dicosmo F, Misawa M (1995) Plant cell and tissue culture: Alternatives for metabolite production,
Biotechnology Advance 13 (3): 425-453.
8. Dixon RA (1999) Plant natural products: the molecular genetic basis of biosynthetic diversity.
Current Opinion in Biotechnology 10: 192-197.
9. Fett-Neto AG, Stewart JM, Nicholson SA, Pennington JJ, and DiCosmo F (1994) Improved taxol
yield by aromatic carboxylic acid and and amino acid feeding to cell cultures of T. cuspidata.
Biotechnology Bioengineering 44: 967-971.
10. Fischer R, Liao YC, Hoffmann K, Schillberg S, Emans N (1999) Molecular farming of
recombinant antibodies in plants. Biological Chemistry 380: 825-839.
11. Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973) Isolation of saponins and sapogenins from
callus tissue of Panax ginseng. Chem Pharm Bull 21(1): 98-101.
12. Goleniowski M, Trippi VS (1999) Effect of growth medium composition on psilostachyinolides
and altamisine production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 56: 215-218.
13. Hu ZB and Alfermann AW (1993) Diterpenoid production in hairy root cultures of Salvia
miltiorrhiza. Phytochemistry 32: 699-703.
14. Issell BF, Rudolph AR, and Louie AC (1984) Etoposide (VP-16-213): An overview. In BF Issell,
FM Muggia, and SK Carter (eds.), Etoposide (VP-16-213)-Current status and new developments.
Academic Press Inc, Orlando.
15. Kadkade PG (1981) Formation of podophyllotoxin by Podophyllum peltatum tissue cultures.
Naturwiss 68: 481-482.
16. Kadkade PG (1982) Growth and podophyllotoxin production in callus tissues of Podophyllum
peltatum. Plant Sci Lett 25: 107-115.
17. Lee JM (2001) Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA.
12

18. Lee CY, Lin FL, Yang CT, Wang LH, Wei HL, and Tsay HS (1995) Taxol production by cell
cultures of Taxus mairei. Proc. Symp. on Development and Utilization of Resources of Medicinal
Plants in Taiwan, Taiwan Agricultural Research Institute, Taiwan. TARI Special Publication 48:
137-148.

suspensions of Taxus baccata. Biotechnol Bioeng 47: 666-676.
31. Silvestrini A, Pasqua S, Botta B, Monacelli B, Heijden R, Verpoorte R (2002) Effect of alkaloid
precusor feeding on a Camptotheca acuminata cell line. Plant Physiology and Biochemistry 40:
749-753.
32. Tabata M, Yamamoto H, and Hiraoka N (1972) Les Cultures de Tissus de Plantes. Colloques
internationaux de CNRS. No 193.
33. Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994) The production of imperatorin from
Angelica dahurica var. formosana by cell suspesion culture. J Agric Assoc China. 168: 32-48.
34. Tsay HS (1999) Tissue culture technology of medicinal herbs and its application of medicinal
herbs and its application in Taiwan. In: CH Chou, GR Waller, and C Reinhardt (eds.), Biodiversity
and Allelopathy: from Organisms to Ecosystems in the Pacific. Academia Sinica, Taipei, Taiwan.
137-144.
35. Verpoorte R (1998) Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary metabolites as
leads in drug development. Drug Discovery Today 3: 232-238.
13

36. Yamada Y, and Sato F (1981) Production of berberine in cultured cells of Coptis japonica.
Phytochemistry 20: 545-547.
37. Yamamoto Y, Mizuguchi R, Yamada Y (1982) Selection of a high and stable pigment-producing
strain in cultured Euphorbia millii cells. Theoretical and Applied Genetics 61: 113-116.
38. Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS (1994) Tissue culture of Dioscorea
doryophora Hance. II. Estabilshment of suspension culture and the measurement of diosgenin
content. Chinese Agronomy Journal 4: 257-268.
39. Wang HQ, Yu JT and Zhong JJ (1999) Significant improvement of taxane production in
suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy. Process Biochemistry 35: 479-
483.
40. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, and McPhail AT (1971) Plant antitumor agents VI.
The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus
brevifolia. Journal of American Chemical Society 93: 2325-2327.
41. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: Intiation, growth optimization,