Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
MỤC LỤC
PHẦN I: MỞ ĐẦU 3
PHẦN II: NỘI DUNG 4
I. CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN 4
1. Enzyme cắt giới hạn 4
2. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn 4
3. Tính chất của enzyme giới hạn 5
3.1 Trình tự nhận biết của RE 5
3.2 Các kiểu cắt của RE 7
4. Danh pháp 10
5. Phân loại enzyme giới hạn 11
5.1. Enzyme loại I 12
5.2. Enzyme loại III 13
5.3. Enzyme loại II 14
6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cắt của RE 16
6.1. Độ tinh sạch của DNA 16
6.2. Mức độ methyl hóa của DNA 16
6.3. Đặc tính methyl hóa của RE 18
7. Ứng dụng của RE 18
II. CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI 19
1. Enzyme polymerase 19
1.1 DNA polymerase 19
1.2. RNA polymerase 26
2. Enzyme gây biến đổi đầu cuối DNA 29
2.1. T4 polynucleotide kinase 29
2.2. Alkaline phosphatase 30
3. Nuclease 31
3.1. DNase I (Deoxyribonuclease I) 31
3.2. Exo III (Exonuclease III ): 32

triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã
cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ
genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào
trong một cơ thể sinh vật khác. Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen
do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định. Enzyme là công
cụ cơ bản trong kỹ thuật tạo dòng phân tử. Sinh học phân tử đã phát hiện và
hiểu rõ cơ chế tác động của hàng loạt enzyme, nhờ đó đã sử dụng chúng như
những công cụ hữu hiệu trong việc cắt nối và ghép các gen.
Trong tạo dòng phân tử có sự tham gia của các enzyme: enzyme
nuclease, DNA-polymerase, ligase và restriction endonuclease. Để hiểu thêm
về các enzyme tạo dòng nên tôi đã chọn đề tài "CÁC ENZYME ĐƯỢC SỬ
DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG PHÂN TỬ "
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
3
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
PHẦN II: NỘI DUNG
I. CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN
1. Enzyme cắt giới hạn
Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme
giới hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự
nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại
các vị trí đặc thù.
Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi
khuẩn đó bị phagơ phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phagơ lại
không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzyme có khả năng
cắt DNA phagơ thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người
đầu tiên tách được loại enzyme này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae
được gọi tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần

enzyme giới hạn đóng vai trò là hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn
nhằm chống lại sự xâm nhập của các phage lạ.
3. Tính chất của enzyme giới hạn
3.1 Trình tự nhận biết của RE
Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị
trí, nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí
xác định. Tuỳ theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại: 260 loại
I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biết và loại
II bao gồm các enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Ở đây chúng ta
chỉ xét các enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng (giống
như con dao mổ tinh vi) cho phép thao tác trên các gene trong kỹ thuật DNA
tái tổ hợp.
Enzyme giới hạn có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất
định và cắt DNA ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận.
Trong tự nhiên các enzyme hạn chế, hiện diện trong hầu hết các tế bào
vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế
bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế
nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
5
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không được nhận biết bởi các
enzyme hạn chế.
Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế của vi khuẩn cắt DNA ở những
trình tự đặc biệt, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, do nó có thể giảm
chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn
hơn. Hiện nay, các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote.
Mỗi enzyme hạn chế chỉ nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt

5’…C CGG…3’
3’…GGC C…5’
6 HaeIII 5’…GG↓CC…3’ 5’…GG CC…3’
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
6
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
3’…CC↑GG…5’ 3’…CC GG…5’
7 BamHI 5’…GGATCC…3’
3’…CCAT↑GG…5’
5’…G GATCC…3’
3’…CCAT GG…5’
8 BglII 5’…A↓GATCT…3’
3’…TCTAG↑A…5’
5’…A GATCT…3’
3’…TCTAG A…5’
9 SmaI 5’…CCC↓GGG…3’
3’…GGG↑CCC…5’
5’…CCC GGG…3’
3’…GGG CCC…5’
10 XmaI 5’…C↓CCGGG…3’
3’…GGGCC↑C…5’
5’…C CCGGG…3’
3’…GGGCC C…3’
Một số enzyme có thể cắt tốt ở trình tự này nhưng lại cắt ít hữu hiệu ở
trình tự khác. Thí dụ enzyme EcoRI cắt ở nơi có trình tự AATT không tốt
bằng ở những nơi có trình tự GAATTC.
3.2 Các kiểu cắt của RE
Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa

đầu 5’ dính (protruding). Một số enzyme hạn chế (ví dụ: PstI) đã tạo ra các
đoạn DNA có đầu 3’ lồi.Ví dụ:
* Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự
Eco RI cắt
5' G-A-A-T-T-C 3' 5' G 5' A-A-T-T-C 3'
3' C-T-T-A-A-G 5' 3' G-T-T-A-A 5' G 5'
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
8
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Bảng 2: Các enzyme endonuclease hạn chế và những đoạn cắt của chúng
Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn
Bam III G G A T C C
C C T A G G
Bacillus amylolique faciens H
Bgl II A G A T C T
T C T A G A
Bacillus globigi
Hind III A A G C T T
T T C G A A
Haemophilus influenzeae R
d
Eco RII C C T G G
G G A C C
Escherichia coli R245
Hpa I G T T A A C
C A A T T G
Haemophilus parainfluenzea
Hha I G C G C

1. EcoRI:
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
- E: Giống Escherichia
- Co: Loài Coli
- R: Chủng RY13
- I: Enzyme được tách lần đầu tiên
Một số ví dụ tương tự: PstI là enzyme giới hạn được tách từ
Providencia stuartii; Fnu DI, Fnu Dn và Fnu DHI, là 3 enzyme xuất phát từ
Fusobacterium nucleatum chủng D; Bst DI021 thuộc vi khuẩn Bacillus
stearothermophilus chủng D102; Một số loại khác như E.coRV, BamHI,
HaeIII, Smal, …
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
10
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
5. Phân loại enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn nằm trong một hệ thống bao gồm cả enzyme sửa đổi,
nó không thể nào tồn tại một mình được. Những chủng vi khuẩn, nếu hệ thống
giới hạn sửa đổi có một enzyme sửa đổi không hoạt động được vì lý do nào
đấy, thì chủng đó không thể nào sống nổi. Lý do chỉ vì DNA không được sửa
đổi sẽ bị enzyme giới hạn tương ứng phá huỷ.
Từ khi hệ thống enzyme giới hạn-sửa đổi B và K của Escherichia coli
được xác định tới nay đã có hơn 2500 hệ thống khác được phát hiện.Trong đó
có gần 200 trình tự đặc hiệu hoàn toàn khác nhau được enzyme nhận ra.
Tất cả enzyme này được phân loại khác nhau tuỳ theo thành phần phân
tử, điều kiện cần thiết để hoạt động, kiểu trình tự nucleotit nhận ra và vị trí cắt.
Lúc ban đầu, enzyme được phân chia ra loại I và loại II dựa chủ yếu trên tính
chất phức tạp của enzyme. Enzyme loại I là đa khả năng, mang cả hai chức

năng hoặc giới hạn
hoặc sửa đổi.
Vị trí nhận
biết
Tạo thành 2 trình
tự không đối xứng
5-7 bp trình tự
không đối xứng
Trình tự gồm 4-6
bp, và đa số trình tự
không đối xứng
Vị trí cắt Không đặc hiệu
Cách xa vị trí
nhận 1000 bp
Cắt phía 3' cách vị
trí nhận 24 -26 bp
Ngay trong hoặc sát
vị trí nhận
Phản ứng:
Endonuclease
Methylase
Một trong 2 phản
ứng có khả năng
xảy ra
Cùng lúc Phản ứng tách rời
5.1. Enzyme loại I
Enzyme loại I tuy đã được phát hiện đầu tiên nhưng chiếm tỷ lệ không
lớn. Enzyme này chia làm 3 họ, mỗi họ có một nhóm gen liên quan đến nhau.
EcoK và EcoB là những enzyme được tìm thấy lần đầu tiên và lại là đại
diện của một họ. Hai hệ thống này đã được nghiên cứu nhiều vì thế chúng góp

Về mặt di truyền, mỗi đơn vị của enzyme được mã do một gen: hrsS mã
cho đơn vị nhận ra trình tự đặc hiệu, hrsR mã cho dơn vị dùng để tiến hành
phản ứng giới hạn và hrsM mã cho đơn vị tiến hành phản ứng sửa đổi. Khi
hrsR bị đột biến, vi khuẩn mang phenotyp r
-
m
+
tức là tế bào còn có chức năng
sửa đổi nhưng mất chức năng giới hạn DNA. Khi hrsS bị đột biến, phenotyp
trở nên r
-
m
+
và vi khuẩn mất cả hai chức năng giới hạn và sửa đổi. Và khi
hrsR bị đột biến thì sự kiện này không bao giờ dẫn đến phenotyp r
-
m
+
vì
phenotyp này dẫn đến sự chết của tế bào do hậu quả enzyme giới hạn phá huỷ
DNA genom không được sửa đổi. Tuy nhiên, các trường hợp gen hrsR bị đột
biến vẫn xẩy ra trong thực tế nhưng phenotyp sẽ là r
-
m
-
. Những gen của các
đơn vị của enzyme loại I đều có cùng một hướng trên DNA. Lúc nào hrsM
cũng đứng trước hrsS trên cùng một operon tách khỏi gen hrsR và vị trí của
gen hrsR là trước hoặc sau nhóm hai gen kia.
5.2. Enzyme loại III

33333res có tính chất cố định cao, còn gen mod có cả vùng cố đinh lẫn vùng
thay đổi. Sản phẩm hai gen này giống sản phẩm của hsdS và hsdM của
enzyme loại I.
5.3. Enzyme loại II
Các enzyme loại II được gặp nhiều nhất và có tính chất đơn giản hơn.
Chức năng giới hạn và sửa đổi được riêng biệt ra. Mỗi enzyme của hệ thống
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
14
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
giới hạn-sửa đổi chỉ mang một trong hai chức năng thôi. Enzyme giới hạn loại
II đòi hỏi một chất hỗ trợ duy nhất để hoạt động, đó là Mg
2+
. Chúng cắt DNA
ngay trong hoặc gần vị trí đích nhận ra. Nhờ đặc điểm này, enzyme giới hạn
loại II đã trở thành các công cụ rất cần thiết trong ngành sinh học phân tử. Mặt
khác, trình tự của vị trí đặc hiệu chúng nhận ra và cắt đi có vẻ không bị hạn
chế ở một số loại trình tự thôi. Đến nay, người ta đã phát hiện hơn 2500
enzyme loại II có khả năng nhận ra tổng số trình tự đặc hiệu khác nhau là 200.
Hiện nay, đa số enzyme mới tìm thấy là các isoschizomer của những enzyme
giới hạn đã được biết tức là chúng nhận ra những trình tự đặc hiệu của enzyme
đó. Độ dài các trình tự đặc hiệu được enzyme loại II nhận biết là từ 4 đến 8
nucleotit. Đa số trình tự là đối xứng, có nghĩa 2 trình tự bổ sung nhau đều
giống nhau. Điều này làm cho việc cắt trở nên đơn giản. Enzyme giới hạn loại
II được hình thành với 2 đơn vị phân tử giống nhau vì vậy sự liên kết này cho
phép tiến hành cắt cùng lúc cả hai chuỗi DNA.
Gen cấu trúc của hơn 50 enzyme loại II đã được xác định trình tự
nucleotit. Protein enzyme giới hạn loaị II có thể chứa từ 157 đến 576 aa, trung
bình là 300 aa. Một điều lạ được nhận xét là khi đối chiếu các trình tự

từ 1,0 - 2,5mM). Tuy nhiên vì spermidine làm kết tủa DNA ở 4
0
C cho nên chỉ
thêm chất này vào sau khi đã thêm các thành phần phản ứng khác đã được ủ ở
nhiệt độ thích hợp trong vài phút. Cuối cùng các phương pháp tách chiết DNA
đều phải tinh chế lại bằng phenol, chloroform và kết tủa bằng ethanol trước
khi đem phân giải enzyme.
6.2. Mức độ methyl hóa của DNA
Một số enzyme cắt giới hạn bị ức chế hoạt tính cắt do đoạn nhận biết có
những nucleotide bị methyl hóa.
Chủng vi khuẩn E.coli nào chứa một trong 2 trình tự bazơ sau bị methyl
hóa, được gọi là vi khuẩn dam nếu có vị trí Adenin trong trình tự GATC bị
methyl hóa và gọi là dam nếu có chứa cytosine ở giữa trình tự CC(A/T)GG bị
methyl hoá.
Vì thế DNA của những plasmid được chiết xuất từ 2 chủng E.coli này
thường có thể bị cắt một phần hoặc không bị cắt bởi những enzyme cắt giới
hạn có đoạn nhận biết giống với một trong 2 trình tự trên. Để tránh điều này
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
16
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
xảy ra, trong kỹ thuật nhân dòng gen, người ta khuyên nên chỉ chiết tách và
dùng DNA của plasmid từ những chủng vi khuẩn E.coli không có chỗ nào bị
methyl hóa.
DNA động vật có vú hiếm khi chứa 5’-cytosine bị methyl hóa, ngược
lại chúng thường có 5’- Guanine bị methyl hóa. Mức độ methyl hóa biến động
từ vị trí này đến vị trí khác, đặc biệt theo loại tế bào từ đó DNA được chiết
xuất ra.
Mức độ methyl hóa trong DNA genome sinh vật bậc cao có thể được

Học K22
17
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Providencia stuarti PstI H 37 70
Microcoleus MstII H 37
Nocardia otitidis caviarum NotI 37 100
Chú thích: nồng độ muối: NaCl hoặc KCl, L≤50mM, M: từ 50-100mM,
H≥100mM
Hệ thống dung dịch đệm thường gồm một dung dịch chính pha trộn với
các nồng độ NaCl, pH rồi thêm các ion đặc thù khác nhau.
Ngoài ra nhiều phòng thí nghiệm còn sử dụng dung dịch đệm tự pha chế
trên cơ sở dùng potassium glutamate và potassium acetate để phân giải DNA.
Đặc điểm chính của những dung dịch đệm này là chúng chứa potassium
glutamate hoặc potassium acetate thay thế NaCl và dùng Tris-acetate thay thế
Tris-Cl. Hầu hết các enzyme giới hạn đều hoạt động tốt trong những dung
dịch đệm này, chỉ trừ khoảng 20% số enzyme chỉ hoạt động tốt trong dung
dịch đệm tối ưu.
Tính phổ biến của dung dịch đệm rất có lợi khi cần phân cắt DNA với
nhiều enzyme, điều này sẽ đỡ gây lãng phí hơn cho nhà nghiên cứu.
Trong quá trình sử dụng enzyme phân giải phải luôn cẩn thận bỏ vào đá
và luôn bảo quản ở nhiệt độ -20 và tuyệt đối không được làm lẫn tạp đặc biệt
với DNA plasmid, với các enzyme khác hay DNase I.
Có một số enzyme khá đắt một số khác thì rẻ hơn, tuy nhiên enzyme đắt
thường lại có chất lượng thấp.
6.3. Đặc tính methyl hóa của RE
Là khả năng của enzyme xúc tác quá trình gắn các gốc CH3 vào vị trí
các bazơ adenine hoặc cytosine trong nội tại trình tự nhận biết đặc thù. Như
enzyme EcoRI có khả năng methyl hóa các bazơ adenine trong nội tại vùng
nhận biết của enzyme này. Nhờ vậy đã ngăn cản không cho chính enzyme đó

mạch khuôn là RNA (thường là mRNA) để tổng hợp lên DNA. Enzyme này
có nguồn gốc từ retrovirus, dùng RNA của virus làm khuôn để tổng hợp lên
DNA copy virus.
Một loại DNA polymerase nữa không tổng hợp mạch mới từ khuôn mà
chỉ thêm một đoạn các nu đồng nhất như poly A vào đầu tận cùng của phân tử
DNA thứ nhất, đó là enzyme terminal transferase. Enzyme này sau đó lại sử
dụng để đính poly T vào phân tử DNA thứ 2. Sau đó 2 phân tử DNA được kết
gắn với nhau qua 2 đầu bổ sung sẽ đính kết lại (ligation) rồi được nhân dòng
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
19
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
lên, quá trình này sử dụng trong tạo vector tái tổ hợp từ 2 đoạn DNA khác
nhau.
Template-independent DNA polymerase là một dạng enzyme terminal
transferase, thêm từng nu vào đầu 3’ của một đoạn mồi đơn DNA, kéo dài
thành một sợi đơn DNA dài.
1.1.2. Đặc tính của DNA polymerase
DNA polymerase muốn hoạt động được thì cần phải có một đoạn mồi
(primer). Mồi có thể là đoạn mạch đơn DNA hay RNA ngắn, bắt cặp bổ sung
với phần đoạn đầu của mạch khuôn để từ đó các polymerase mới kéo dài thêm
từng nu một gắn vào đầu 3’OH.
Tất cả các DNA polymerase đều thêm deoxynucleotit vào nhóm OH tận
cùng đầu 3’ của phân tử DNA mạch đơn ngắn, hoạt tính trùng phân xẩy ra
luôn theo hướng 5’-3’ của DNA polymerase. Mỗi một nu được gắn vào mạch
mới đối xứng với nu của mạch đối diện (mạch khuôn), theo nguyên tác dA
ghép cặp với dT, dC ghép cặp với dG. Phản ứng yêu cầu 4dNTP và ion Mg
2+
.

một cách liên tục vào mồi mà không cần tách rời khỏi khuôn- mồi. Hầu hết
các DNA polymerase như E.coli DNA polymerase I, Klenow fragment, T4
DNA polymerase có tính liên tục thấp, chúng thường tách rời khỏi mồi khuôn
sau khi ghép vào mạch dưới 10 nu. Ngược lại T7 DNA polymerase lại có tính
liên tục cao, nó có thể gắn hàng ngàn nu bắt đầu từ mồi mà không phải rời ra
khỏi mồi-khuôn. Đặc tính này rất tốt khi muốn tổng hợp một sợi DNA dài.
1.1.3. Enzyme polymerase
1.1.3.1. DNA polymerase I
Do Lehman phát hiện vào năm 1981, là sản phẩm của gen E. coli pol A,
gen này đã được nhân dòng trong thực khuẩn thể lamda, và được kích hoạt
mạnh bởi nhiệt độ. Enzyme có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn có khối
lượng phân tử 109.000 Da. Là enzyme có cả 2 đặc tính exonuclease 3’-5’ và
5’-3’, nhưng hoạt tính exonuclease 3’-5’ của nó so với T4 và T7 polymerase
thì yếu hơn nhiều.
Enzyme E. coli DNA polymerase I Knenow Fragment (Klenow
Fragment of E. DNA polymerase I) có khối lượng phân tử 76.000 Da, chứa
trình tự đầu C và được cắt bỏ 323 axit amin từ đầu amin, chỉ còn lại 70%
chuỗi peptide của enzyme E.coli DNA polymerase I. Enzyme này duy trì
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
21
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
được đặc tính trùng phân và hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease của E.coli
polymerase I, nhưng không có đặc tính 5’ – 3’ exonuclease.
1.1.3.2. T4 DNA polymerase
Là enzyme được mã hóa bởi coliphage T4, là sản phẩm của gen 43 của
bacteriophage T4. Nó không những được chiết xuất từ tế bào E.coli bị phage
xâm nhiễm hoặc được sản xuất từ gen 43 nhân dòng. Enzyme T4 DNA
polymerase là một chuỗi polypeptide đơn có khối lượng phân tử 12000 Da.

hàng ngàn nu. Tính liên tục cao của phức hợp protein gen 5 T7 với protein
thioredoxin (T7 DNA polymerase) đã khắc phục được đặc tính liên tục thấp
của enzyme E.coli DNA polymerase I, Klenow fragment và T4 DNA
polymerase.
T7 DNA polymerase có hoạt tính phân rã 3’-5’ exonuclease cao đối với
cả sợi DNA đơn và kép. Vì thế nó không được dùng trong phân tích trình tự
DNA.
Hiện có thêm một số T7 DNA polymerase được biến đổi, nó khác là có
hoạt tính phân rã 3’-5’ exonuclease rất yếu do enzyme này mất 28 axit amin
trong vùng tạo hoạt tính exonuclease, nhưng ngược lại làm tăng hoạt tính tổng
hợp lên từ 3-9 lần.
Ứng dụng enzyme này khi cần tổng hợp những đọan DNA dài.
1.1.3.4. Taq polymerase
Taq polymerase đầu tiên được Lawyer et al phân tách vào năm 1989, từ
một loài vi khuẩn sống ở suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus.
Enzyme này chịu trách nhiệm tổng hợp cả 2 sợi đơn DNA, có khối lượng phân
tử 94kDa, hoạt động tối ưu trong phạm vi nhiệt độ từ 75-80
0
C, và không có
hoạt tính phân rã 3’-5’ exonuclease.
Enzyme cấu tạo gồm một chuỗi polypeptide đơn với số lượng thay đổi
và có hoạt tính liên tục cao.
Do Taq polymerase hoạt động mạnh trong phạm vi nhiệt độ rộng và có
nhiệt độ trùng phân tương đối cao. Điều này rất có lợi khi sử dụng chúng trong
phản ứng chuỗi trùng phân. Nhiệt độ cao đã cho phép quá trình ghép cặp giữa
mồi với nguyên bản được đặc thù hơn, vì thế sẽ làm tăng được hiệu quả, tính
đặc thù và tính nhạy cảm của phương pháp PCR.
Enzyme giữ được hoạt tính qua nhiều chu kỳ lặp lại từ nhiệt độ tiếp cặp
mồi đến nhiệt độ tách sợi đơn trong PCR, điều này đã giúp chúng ta chỉ cần
nạp enzyme một lần vào phản ứng trước khi chạy các chu kỳ tiếp theo.

này xúc tác rất chậm khoảng 5nu/giây, chậm hơn 100 lần tốc độ kết gắn do
enzyme T7 DNA polymerase, đồng thời enzyme này không có hoạt tính phân
rã 3’-5’ exonuclease.
- Ứng dụng
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
24
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
+ Tổng hợp cDNA từ mRNA để nhân dòng tạo thư viện cDNA, khi đó
người ta thường dùng 2 loại mồi là oligo (dT) cho mRNA và những đoạn
oligodeoxynucleotide ngẫu nhiên cho RNA virus. Trường hợp thứ 2 các mồi
sẽ ngắn ngẫu nhiên trên các vị trí khác nhau của các RNA và kết quả sẽ tạo ra
các cDNA khác nhau.
+ Để lấp đầy đầu 3’ của những đoạn DNA có đầu 5’ nhô ra, vì enzyme
này không có hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease.
+ Dùng trong xác định trình tự DNA, vì do enzyme này không có hoạt
tính 3’ – 5’ exonuclease nên có thể tổng hợp đi qua những vùng mà enzyme
Klenow fragment không tiến hành vượt qua được.
1.1.3.6. Enzyme terminal deoxynucleotide transferase)
Enzyme được li trích từ tuyến ức của bê, xúc tác việc kết gắn những
deoxynucleotit vào đầu 3’OH của sợi DNA đơn một cách ngẫu nhiên, đồng
thời giải phóng ra gốc phosphate vô cơ.
Enzyme hoạt động không cần khuôn mà vẫn cho phép từng nu một
nhập vào chuỗi, nhưng yêu cầu môi trường phản ứng phải có mặt của cation
hóa trị 2. Việc hấp thụ các nu nhập vào chuỗi phụ thuộc vào loại cation hóa trị
2. Mồi thường là một sợi DNA đơn, đối với sợi DNA kép thường quá trình
kéo dài có hiệu quả nhất khi đầu của DNA có chứa đầu 3’ nhô ra. Tuy nhiên,
sự có mặt của Co2+ thì enzyme này sẽ bắt đầu kéo dài từ bất kỳ đầu 3’ nào dù
là nhô ra, bằng hay lõm, mặc dù quá trình tổng hợp không có hiệu suất đồng