Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ

Tóm tắt: Enzyme là những protein hoạt tính sinh học vả dựa vào loại phản ứng
xúc tác mà trong sinh học phân tử có thể chia enzyme thành 6 nhóm khác nhau.
Trong đó các nhóm enzyme giới hạn, enzyme polimerase, enzyme nối, các
enzyme nuclease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực của
sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền. Enzyme được sử dụng trong các kĩ thuật
sinh học phân tử như RFLP, PCR, tách dòng phân tử.........
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản: (1). Enzyme giới hạn, (2). các
nhóm enzyme khác; (3). Enzyme nuctease.

Hệ thống enzyme có thể chia thành 6 nhóm tuỳ theo loại hình phản ứng
mà các enzyme này xúc tác. Nhóm enzyme nuclease có tác dụng cắt và phá huỷ
ADN, nhóm ADN-ligase có chức năng nối các trình tự ADN lại. nhóm enzyme
ADN-polimerase tham gia tổng hợp chuỗi polinucleotit, nhóm enzyme ADN-
polimerase sửa chữa có chức năng sửa chữa những sai sót trong phân tử ADN,
nhóm enzyme topoisommerase tác dụng mở xoắn ADN, nhóm enzyme phiên mã
ngược reverse-transcriptase xúc tác cho quá trình phiên mã ngược từ ARN thành
cADN. Các nhóm enzyme trên có vai trò hết sức quan trọng trong các thao tác
với ADN và trong công nghệ ADN tái tổ hợp. Trong số đó có các nhóm enzyme
giới hạn, enzyme sửa chữa ADN, ADN-polimease, ADN-ligase....

§1. ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮT
HẠN CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE)
1.1. Khái niệm
Nhóm enzyme nuclease gồm DN-ase và RN-ase có khả năng bẻ gãy liên
kết phosphodiester kết quả là phân huỷ phân tử ADN hoặc ARN.
Nhóm enzyme ADN-ase gồm 2 loại: Exonuclease (enzyme cắt ADN
ngoại bào) có tác dụng cắt từng cặp nucleotit từ hai đầu của đoạn ADN đi dần
vào bên trong (hình 4.1). Enzyme exonuclease có thể cắt tỉa từng cặp nucleotit ở

động đơn giản nhất, chúng là các nuclease, và vì chúng cắt tại một vị trí nằm bên
trong sợi ADN và không phân huỷ ADN từ hai đầu, nên gọi là endonuclease.
Bảng 4.1. Đặc điểm của các loại enzyme giới hạn
Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III
Điểm cắt Xa điểm nhận biết
hơn 1000 bp
Nằm trong điểm
nhận biết
Nằm ngoài điểm
nhận biết nhận biết
Khả năng methy hóa gốc
Adenine
Có Không Có
Điều kiện để cắt ATP,Mg
++
, Mg
++

S-AdoMet
Mg
++
hoặc Mn
++
Mg
++
, S-AdoMet
Cấu trúc của enzyme (số
chuỗi polipeptide)
Khác nhau Giống nhau Khác nhau


đoạn có thể sinh ra: (1) Các đoạn đầu bằng (blunt ends); (2) Các đoạn đầu dính
(so le) với 2 kiểu: đoạn có đầu 3' nhô ra; và đoạn có đầu 5' nhô ra.

Hình 4.3. Các kiểu cắt của RE nhóm II
Các enzyme như PstI và EcoRI tạo ra các đoạn ADN có đầu dính, chúng
có thể bắt cặp bazơ với trình tự bổ sung cũng do chính enzyme đó tạo ra. Như
vậy, bằng cách cắt hai mẫu ADN khác nhau bởi cùng một enzyme và trộn các

53
đoạn đó với nhau có thể tạo ra ADN tái tổ hợp. Bằng cách này các đoạn ADN
nguồn khác nhau có thể nối lại với nhau nếu chúng có các đầu dính do enzyme
giới hạn sinh ra. Khi các vùng bổ trợ ghép với nhau thì bộ khung photphodiester
được gắn lại bằng ADN ligase.
Trong thực nghiệm, người ta trộn một lượng thích hợp enzyme với ADN
caanf nghiên cứu trong dung dịch đệm, cho phản ứng diễn ra ở 37
0
C. Hoạt tính
enzymc được do bằng đơn vị tương đương với lượng enzyme cần thiết để một
microgam ADN trong một giờ ở 37
0
C.
1.3. Lập bản đồ cắt giới hạn
Phần lớn các đoạn ADN đều có các điểm nhận biết đối với nhiều enzyme
giới hạn khác nhauvà nếu biết được vị trí tương đối của một số điểm này thì có
thể lập được bản đồ các điểm giới hạn. Trong kĩ thuật này, người ta sử dụng các
enzyme giới hạn để cắt một đoạn ADN, sau đó điện di trên agrose, chụp ảnh
phân tích được kích thước các đoạn ADN bị cắt. Từ các kết quả phân tích có thể
xác định được vị trí tương đối của các điểm được cắt trên phân tử ADN.

Hình 4.4. Kiểu cắt của một số loại enzyme